Cell：lncRNA功能大发现——稳定细胞染色体
前期研究发现，有一系列鼠源的lncRNA参与调控DNA损伤应答，其中一些lncRNA在哺乳动物中存在高度的保守性，例如2900097C17Rik，在人转录组中存在与之高度保守的lncRNA，名为NORAD，但研究者们并不清楚此lncRNA是否也具有与DNA损伤应答及染色体稳定性调控等相关的功能。近日，来自美国西南医学中心的分子生物学家们发现NORAD对基因组稳定性的作用，相关文章于近日发表于Cell。
科学问题
NORAD是否具有DNA损伤应答与染色体稳定性调控等相关功能？又是通过什么机制发挥这些功能？
结果概述
1. lncRNA NORAD在DNA损伤的细胞中大量表达，且NORAD的缺失会导致细胞染色体不稳定，证明NORAD是一个与DNA损伤和染色体不稳定相关的lncRNA分子；
2. 通过RNA pull-down结合蛋白组分鉴定和CLIP-seq等多种手段，证明NORAD在细胞内与PUMILIO家族的蛋白PUM1/2结合；
3. 结合NORAD和PUM1/2的过表达和敲除实验，证明NORAD通过抑制PUM1/2的活性，从而维持染色体的稳定性。
研究结论
NORAD通过结合PUMILIO蛋白抑制其调控mRNA的功能，NORAD的缺失会导致PUMILIO蛋白的异常活跃，从而导致细胞染色体的非整倍性。
研究过程
一：人源NORAD是否与鼠源2900097C17Rik同样具有调控DNA损伤应答及染色体稳定性的功能？
1. NORAD在人体细胞中是否真实存在？是否与DNA损伤应答相关？
Figure 1. NORAD在DNA损伤模型中表达显著上调
为解决这两个疑问，研究者首先对基因组上NORAD位点的RNA聚合酶II结合信息及H3K4me3甲基化修饰信息进行了分析，同时结合3’RACE等手段鉴定了NORAD序列的长度并分析了其编码能力。此外，通过相对定量和绝对定量PCR的方法，证明NORAD在DNA损伤的HCT116细胞中表达显著上调。
2. 在DNA损伤应答过程中上调的NORAD发挥怎样的功能？
Figure 2. NORAD的敲除导致了细胞染色体的非整倍性
为了进一步研究NORAD在DNA损伤应答中的上调有怎样的功能，研究者通过TALEN技术在HCT116细胞中敲除了NORAD，发现细胞染色体出现了非整倍性的情况，说明NORAD敲除会影响染色体的稳定性。
3. 这种对染色体稳定性的影响是NORAD介导的，还是TALEN技术本身导致的？
Figure 3. 对染色体稳定性影响是由NORAD介导的
为排除TALEN技术的干扰，研究者采用了两种方式来进行证明。首先，研究者在基因组的其它位置使用TALEN技术进行敲除，发现对染色体的稳定性并没有显著的影响。此外，研究者使用siRNA抑制了NORAD的表达，发现细胞出现了染色体非整倍性。证明NORAD的确在维持染色体稳定性方面有重要的作用。
二：NORAD在细胞内的作用有怎样的分子机制？
Figure 4. NORAD与PUMILIO蛋白PUM1和PUM2有结合作用
为阐明NORAD发挥功能的潜在机制，研究者使用RNA pull-down鉴定了NORAD结合的蛋白，通过严格的筛选，发现仅有PUM2与NORAD有较强的结合作用。进一步Western Blot验证发现同家族的PUM1同样与NORAD有结合作用。CLIP-seq的数据进一步支持了NORAD与PUM1/2的结合，结合CLIP数据和信息学预测也发现NORAD上存在15个结合位点。由于NORAD在细胞中高表达，因而对PUM1/2有非常强的结合作用。
三：NORAD对染色体稳定性的调节是否就是通过PUM1/2蛋白来发挥功能的？
1. PUM1/2蛋白是否同NORAD一样调控染色体稳定性？
Figure 5. NORAD通过调控PUM1/2蛋白活性发挥功能
通过对CLIP-seq结果分析发现，在敲除NORAD后，PUM2调控的基因表达量出现了明显的下调。同时PUM1/2的过表达同样导致了染色体的不稳定，进一步的基因拯救实验进一步验证了NORAD通过PUM1/2对染色体稳定性的调控。
2. NORAD-PUM1/2通过调控哪些下游基因发挥功能？
Figure 6. NORAD-PUM1/2调控大量染色体稳定性相关基因
为了进一步研究NORAD-PUM1/2的靶基因，研究者筛选了NORAD敲除后表达下调、且在CLIP-seq实验中发现与PUM2蛋白直接结合的基因，Gene Ontology分析发现大量与染色体稳定性和DNA损伤修复相关的基因受NORAD-PUM1/2的调控。研究者进一步使用qPCR对其中重要基因的表达水平进行了验证，进一步证实NORAD-PUM1/2与染色体稳定性相关基因之间的调控关系。
Figure 7. NORAD通过PUMILIO蛋白维持染色体稳定性原理示意图
以上研究发现，PUMILIO蛋白PUM1和PUM2在细胞中通过结合染色体稳定性相关基因的mRNA发挥抑制功能，PUMILIO的异常活跃会导致细胞染色体的不稳定。细胞中的lncRNA NORAD能通过结合PUM1/2抑制过度活跃的PUM1/2，维持PUM1/2下游基因的正常表达水平，从而维持细胞染色体的稳定性。本研究首次揭示了lncRNA在维持细胞染色体稳定性中的重要功能，为后续染色体稳定性及染色体异常相关疾病的研究提供了新思路。
参考文献：Lee S, Kopp F, Chang T C, et al. Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins[J]. Cell, 2015.