Nature communications：染色体不稳定性的程度和部位决定了其致癌潜能
2020年3月20日荷兰乌得勒支市乌得勒支市昂科德研究所、胡布雷赫特研究所和大学医学中心Geert J.P.L. Kops & Nannette Jelluma 教授在Nature communications上发表Degree and site of chromosomal instability define its oncogenic potential。由于染色体不稳定（CIN）表型，大多数人类癌症是非整倍体。然而，尽管CIN和非整倍体是癌症的标志，但它们在肿瘤形成中的作用尚未明确地从动物实验中显现出来，因此仍不清楚。使用不同程度CIN的条件小鼠模型，作者发现特定范围足以驱动肠内非常早发的自发性腺瘤形成。在易患肠癌的小鼠（ApcMin）中，中度CIN可显著增加整个肠道的腺瘤负担，尤其是结肠远端的腺瘤负担，这与人类疾病相似。值得注意的是，高水平的CIN比中等水平的CIN更能促进远端结肠腺瘤的形成，但对小肠却没有影响。因此，作者的结果显示CIN可能具有潜在的致癌作用，但在不同的组织中，CIN的某些水平可能具有相反的作用。
染色体数目异常的非整倍体是人类肿瘤的特征。在胚胎发生过程中，几乎所有的非整倍体都是致命的，正常组织中的非整倍体水平很低，但70%-90%的实体瘤中观察到染色体畸变。非整倍体是染色体不稳定（CIN）的结果：有丝分裂过程中染色体偶尔增加或减少。CIN可导致基因组不稳定，并与肿瘤内基因组高度异质性、免疫逃避和促进转移有关。此外，CIN和非整倍体与肿瘤侵袭性、抗药性和患者预后不良相关。结直肠癌（CRC）是一种常见的恶性肿瘤，其CIN和非整倍体的发生率较高。结直肠癌分为遗传型和散发型，均以微卫星不稳定型（15%）和CIN（85%）肿瘤为主。CIN与患者预后不良相关：对63项共10126例CRC患者（60%的非整倍体肿瘤作为CIN的替代物）的荟萃分析显示，CIN肿瘤对5-氟尿嘧啶治疗的反应比非CIN肿瘤差，CIN患者的（无进展）生存率较低。尽管有上述相关性，CIN和非整倍体在肿瘤形成中的作用仍不清楚。CIN的小鼠模型偶尔显示出偶发的、自发的肿瘤，潜伏期很长（>12-18个月），并且主要在脾脏和肺，这表明CIN不是一个有效的癌症驱动因素。在易患癌症的小鼠中，CIN要么是中性的，促进肿瘤形成，要么在某些情况下抑制肿瘤形成。然而，由于使用不同的致癌背景、所检测组织的差异以及组织暴露于CIN的方式和时间，这些研究之间的比较非常困难。此外，由于技术上的限制，通常无法直接测量相关组织中的CIN，并且不同模型中的致癌作用不能归因于不同的CIN水平。因此，作者建立了一个基因小鼠模型，允许以组织特异性的方式控制诱导不同程度的CIN。利用这个模型，作者直接比较并发现不同程度的CIN对肿瘤形成的影响有显著差异：中到高的CIN水平足以驱动肠道肿瘤的早期形成，而中到高的CIN是最有效的。此外，在不同的组织中，类似的CIN水平驱动或促进肿瘤形成的能力并不相同。
图1：体内CIN分级增加的等位基因序列
活体中CIN分级升高的等位基因序列
为了实现CIN水平的组织特异性诱导，作者在纺锤体组装检查点激酶Mps1（图1a，b，）中创建了携带条件T649A（TA）或D637A（KD；kinase-dead）突变的小鼠菌株。人类细胞系中的类似突变分别导致轻度或重度CIN。作者推断，将这些Cre诱导的Mps1敲入（CiMKi）等位基因（与野生型Mps1结合）将导致CIN的等位基因序列，范围从非常低（很少失误，大多是轻微错误）到非常高（很多失误，大多是严重错误）。CiMKi小鼠出生时健康，符合孟德尔比例。通过向CiMKi小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）添加4-羟基三苯氧胺（4-OHT）激活Cre重组酶；Rosa26-CreERT2小鼠导致突变Mps1 mRNA的高效重组和表达，将突变的MPS1蛋白翻译成与野生型蛋白相当的水平。如预期的那样，等位基因序列导致MPS1活性分级下降。4-OHT处理的永生化MEFs的延时显微镜显示随着MPS1激酶活性的降低，有丝分裂错误显著增加（图1d），验证了等位基因序列的预测表型。对肠组织切片的后期图分析表明，CIN的预期范围被诱导成功（图1e）。此外，单细胞全基因组核型测序（scKaryo-seq）显示，在诱导中度、高度和极高CIN后一周，小肠内的非整倍体和核型异质性均增强（图1f）。因此，作者认为CiMKi小鼠模型能够在体内对一系列CIN进行时空控制。
图2：中度CIN引起肠内早期自发性肿瘤的发生
中度CIN可导致早期肠肿瘤的发生
CiMKi中的全身突变诱导；Rosa26-CreERT2小鼠扰乱小肠组织（图2a）。紊乱的程度与CIN的程度相关，可能解释了CIN高和非常高的小鼠出现的严重体重减轻。为了研究在不影响其他器官的情况下在肠道中早期诱导CIN，从性交后12.5天开始产生了CiMKi-Villin-Cre小鼠，以实现突变诱导。所有CiMKi-Villin-Cre小鼠均健康，正常生育，未出现腹泻、体重减轻等肠道功能障碍迹象，也未出现任何其他健康问题迹象，如姿势异常、不能活动或无反应。此外，作者在12周或8个月时没有观察到任何一般组织特征的异常，除了中度CIN组。此外，根据亚甲基蓝染色（图2b-d）判断，中度CIN在12周龄时已在这些小鼠的小肠中造成一个或多个损伤。通过组织学分析，作者证实这些小鼠确实发生了多种不同大小的低级别腺瘤（图2e）。这些腺瘤对核连环蛋白呈阳性，表明CIN足以诱导组成性Wnt途径活化（图2f）。此外，在中度CIN组中，作者在一只小鼠的结肠中发现了一个大型低级别腺瘤（图2g）。为了进一步了解不同程度CIN对肿瘤发生的反应性差异，作者进一步分析了12周龄小鼠结肠和小肠组织的存活率和增殖活性的差异。作者发现在活隐窝的数量上（由每个隐窝中pHH3的阳性率确定）和增殖活性上没有显著差异。在结肠和小肠中，作者观察到每个隐窝的有丝分裂（pHH3阳性）细胞和每个隐窝的凋亡细胞（基于形态学）随CIN程度的增加而增加。然而，作者没有观察到中度到极高CIN之间的显著差异。因此，CIN可以导致很早的发病，自发的肿瘤发生。CIN的这种作用在不同程度的CIN之间是不同的，在中度CIN的小鼠中效果最强（图2c、d、g）。综上所述，这些数据表明不同的CIN水平对自发肠肿瘤的发生有不同的影响。术后一般组织特征检查然而，CIN诱导并没有对此提供明显的解释。
图3：CIN在肿瘤易感肠中的致癌潜能
程度和部位决定了CIN的致癌潜能
人类结直肠癌（CRCs）常为非整倍体，其中绝大多数是由Wnt途径成分（如APC47-C49）基因的功能突变引起的。此外，APC杂合子丢失可导致家族性腺瘤性大肠息肉病（FAP）综合征患者中广泛的息肉生长。为了研究CIN对易患癌症的组织的影响，作者接下来研究了携带突变Apc等位基因（ApcMin）的CiMKi小鼠。ApcMin小鼠通常在小肠中约30个腺瘤，结肠中没有或很少。与CiMKi-Villin-Cre小鼠相比，ApcMin背景（CiMKi-KD/KD；ApcMin/；Villin-Cre）中很高的CIN是胚胎致死性的，排除了对这一CIN水平的进一步分析。当30、36、54岁的小鼠在预期的12周内死亡时，中度或高度CIN的小鼠因体重下降而在6-8周内死亡。ApcMin中度CIN小鼠的小肠腺瘤数量显著增加（图3a-c）。然而，高CIN和低CIN都没有同样的作用，这表明小肠腺瘤的形成对狭窄的CIN范围是敏感的。对同一CiMKi；ApcMin-Villin-Cre小鼠结肠的宏观检查显示，与对照组和低CIN小鼠相比，中、高CIN小鼠结肠被大腺瘤广泛覆盖（图3d-f图3B）。这在结肠远端最为明显，在那里非整倍体APC突变肿瘤也最常见于人类。发病率为100%，并且在ApcMin背景中，腺瘤的数量明显高于其他CIN模型的报告。重要的是，从这些结肠腺瘤中建立的类器官中的CIN仍然与预期水平相对应（图3g），这表明高CIN水平并不是针对腺瘤形成后选择的，也不存在朝着“最佳”CIN水平的漂移。值得注意的是：虽然单个腺瘤的大小在所有诱导的CIN水平之间是可比的，但CIN水平中等或高的腺瘤在很大程度上更早达到这个大小。因此，作者假设CIN会提前启动，加速生长肿瘤，或两者兼而有之。在人类中，结肠远端的肿瘤通常被认为是CIN导致，因为它们是典型的非整倍体和核型不均一的。由于CiMKi-ApcMin-Villin-Cre中、高CIN小鼠模拟了这种远端结肠肿瘤状态，作者接下来评估了结肠腺瘤的非整倍体和拷贝数改变（CNAs）的异质性。结果显示，随着CIN的升高，非整倍体和核型异质性增加（图3g，h）。18号染色体含有Apc等位基因（在人类FAP肿瘤中经常受到LOH的影响），在绝大多数细胞中是二倍体。由于ApcMin小鼠的腺瘤形成需要野生型Apc的LOH，并且由于CiMKi结肠腺瘤器官样体独立于Wnt配体生长，这表明CIN引起的Apc的LOH发生在整个18号染色体丢失之外，如之前所述。靶向PCR只检测到ApcMin等位基因，强烈提示LOH是由两条染色体18的双不分离事件或体细胞重组完成的，后者可能是FAP患者中APC-LOH的原因。这两个过程都可以被CIN加速。作者的数据表明，在相同的遗传背景下，CIN对染色体核型异质性和肿瘤形成的影响取决于CIN的程度和CIN发生的组织。由于高CIN可导致大量结肠腺瘤，但并未增加小肠腺瘤的形成，因此类似范围的CIN的作用可能有很大不同在组织之间。为了更好地了解组织对CIN的敏感性，作者首先评估了相同CiMKi突变导致小肠和结肠CIN水平不同的可能性。尽管结肠和小肠器官的延时成像显示两种组织之间的CIN水平不相同（在ApcMin背景下），但对肿瘤形成有显著不同影响的基因型（图3c，f）具有可比的CIN水平。
图4：促进结肠的增殖，但不促进小肠的增殖
例如，结肠中的CiMKi-TA/TA与小肠中的CiMKi-TA/KD）（图4a，b）。然而，值得注意的是，中度和高CIN导致CiMKi-ApcMin-Villin-Cre小鼠在4周龄时（大致是腺瘤发生的时间）结肠中的增殖间隔显著扩大，但小肠中没有（图4c-f）。各基因型间增殖细胞百分比（增殖指数）相似，因此隐窝中的增殖细胞总量增加（图4C，D）。所以，中、高CIN小鼠结肠中的细胞可能更容易保持增殖状态，增加了转化细胞在结肠隐窝中繁殖的机会。小肠中没有观察到这种增殖状态的增加，这也再次强调了这些组织之间CIN反应的差异。
总之，作者的研究意义在于利用CiMKi模型准确地研究CIN与肿瘤发展在组织和遗传背景中的相互作用。因为CiMKi对CIN的严格时空控制也使人们能够研究不同水平CIN对癌细胞扩散的影响，以及可能的肿瘤消退。后者可以极大地帮助正在进行的检查CIN是否恶化的工作，例如通过MPS1小分子抑制剂，是否有可能应用于癌症治疗？
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-15279-9