科研 | 树木，真菌和细菌：响应土壤污染的根际微生物的转录组学
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导 读
恢复受人为污染物污染的土地的一种方法是通过植物修复，通过种植特定作物来修复土壤。植物修复作物（如沙柳属植物）在污染土壤中耐受甚至繁殖的能力依赖于高度复杂且主要是隐蔽的微生物相互作用群落。从紫花苜蓿中差异表达和注释的839个重叠群显示转录学显着增加编码非生物应激反应，如谷胱甘肽S-转移酶，是受污染树木的根部以及真菌相互作用的标志，如SWEET2（转运蛋白）。总共有8252个差异表达转录物来源于真菌，污染导致群落从子囊菌转变为担子菌属。为了应对污染，1745个担子菌转录物丰度增加（大部分在污染土壤中独特表达）。此外，来自未表征的肠杆菌科物种的639个差异表达多顺反子转录物在污染条件下具有更高的丰度，并且包含参与真核生物相互作用，生物膜形成和双加氧酶烃降解。根和真菌基因表达涉及编码碳水化合物/氨基酸（C / N）代谢的转录物，而细菌基因表达包括生物膜相互作用和污染胁迫的直接减少所必需的反应。
论文ID
原名：Trees, fungi and bacteria: tripartite metatranscriptomics of a root microbiome responding to soil contamination
译名：树木，真菌和细菌：响应土壤污染的根际微生物的转录组学
期刊：Microbiome
IF：9.133
发表时间：2018
通信作者：N. J. B. Brereton
通信作者单位：加拿大蒙特利尔大学
实验内容
1. 装配，映射和注释
从序列读数中总共组装了189,849个重叠群。总体而言，125,151个重叠群（66％）被注释为编码转录物的潜在蛋白质，但是64,698个重叠群（34％）在SwissProt，Trembl或nr数据库中没有蛋白质同源物，因此被称为未知。注释的转录组包括91,053个真核生物（48％），33,222个细菌（18％），187个古细菌（0.01％）和139个病毒序列（0.01％）（图1）。正如可以预料的那样，从真核生物中注释的转录组主要来自植物（46,817），尽管紧随其后的是真菌（40,352），多细胞动物（1417），变形虫界（918），菌界（617），眼虫动物界（390），囊泡虫（198）和其他（如宏基因组或环境样本）仅包含较小比例的转录组多样性（324）。
群落构成
这里采用另一种自上而下的方法，它接受微生物组群的不确定性，在系统内组装尽可能多的重叠群，并对所有保留的重叠群进行差异表达分析。明确鉴定为来自旱柳（来自旱柳94006基因组的大多数）的转录物构成了85.6％（40,098）植物物种的重叠群。剩下来自非常近亲的杨树（9.0％）。在转录组中发现了非凡的真菌多样性。虽然RNA是从洗过的根中提取的，但这种多样性并不令人惊讶，因为大多数植物物种都被认为采用（广泛多样化的）地下真菌结合，以便在生物圈中生存和竞争。测序为观察这种不透明的地下遗传物种提供了独特的机会（图1）。真菌群落由初级注释组成40,352个不同的重叠群。细菌多样性极高。由从根提取的RNA组装的这些细菌重叠群非常密切地反映了Yergeau等人在先前实验中报道的群落。使用16S rRNA测序，其中根际细菌与在相同污染中生长的相同柳树品种相关，也由变形菌门主导。作者使用16S rRNA测序在阶段水平上确定了广谱细菌;虽然该方法在数量上与这里使用的方法不具有可比性，但群落构成的比例在门和级别上大致相似。
图1：总注释。整个转录组装配的注释（包括非差异表达的重叠群）。
2.差异表达的重叠群
2.1. 基因表达模式
在未污染和污染的土壤条件下，总共有12,576个重叠群被确定为差异表达（图2）。由于土壤高石油烃的浓度，差异表达的重叠群可直接响应烃毒性或环境改变。除此之外，差异表达也可能是由于次要反应代表了微生物组群落的变化，或者实际上是其他生物体的表达，而不依赖于群落的变化。所有组装的重叠群中很大一部分是未知的（34％），在主要蛋白质库中没有同源序列。尽管通常丢弃未知序列，但由于未知差异表达序列可能代表新的生物和功能，因此此处报告的策略非常有意地维护数据。超过20％的差异表达序列确实是未知的将来自非模型植物的高度复杂的基因表达数据汇集后可以给出生物系统概述的印象，这里给出了样本中所有生物的水平。
2.2 旱柳
共有839个差异表达重叠群被注释为旱柳，占来自根的所有差异表达重叠群的6.7％。对于污染，重叠群（45％）或下调（55％）的数量相似（图2和3）。尽管这里研究的菌株/栽培品种与测序的参考基因组的品种相同，但是从其他植物物种中更好地注释了旱柳131个重叠群。这与另一项研究是一致的，该研究表明，与从单独的非克隆参考基因组作图相比，从头测序可以捕获更多的序列变异。虽然旱柳差异表达重叠群的多样性在系统内相对较低，但除了未知之外，它们具有最高的相对丰度。
2.3 直接减毒/减压反应
在高石油烃污染环境中对植物基因表达的期望将包括细胞色素P450单加氧酶的增加。在鉴定为编码细胞色素P450家族蛋白的26个差异表达转录物中，18个在对照根中具有更高的丰度。只有两个被注释为假定的单加氧酶，其中一个上调，一个下调。另一种预期的应答诱导的解毒反应，是转录组丰度依赖性的，是谷胱甘肽S-转移酶（GST），其催化谷胱甘肽与广泛的异生素结合，以促进液泡负荷。只有一个GST在污染土壤的根部被下调，其中13个在相对丰度水平一直较高的情况下被上调（图2）。UDP-葡萄糖：类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶是受污染根中最丰富的上调旱柳基因，另外两种假定的同种型也被高度上调（图2）。黄酮类葡萄糖基转移酶表达的增加代表了植物减毒中常见的结合机制。UDP-葡萄糖：黄酮类7-O-葡萄糖基转移酶，其允许与大豆中的微生物共生相互作用，可以限制异黄酮结合物的液泡负载，并且相应的缀合物水解β-葡萄糖苷酶定位于植物根质外体。在与微生物的广泛相互作用方面显而易见的根深蒂固。
2.4 氮和碳水化合物的运输
五种氨基酸转运蛋白是差异表达的，两种在未受污染的树木中含量较高，三种在受污染的树木中。两种是不同的阳离子氨基酸转运蛋白，一种在非污染条件下具有较高丰度，在污染条件下一种较高。另一种在污染条件下较高的转录组与杨树中的AAP6最相似，其余两种转运蛋白与液泡氨基酸转运蛋白相似。AAP6是一种已知在根中表达的酸性和中性氨基酸转运蛋白，在具有高底物亲和力以及对天冬氨酸具有亲和力。七种硝酸盐/肽转运蛋白，其中六个差异表达的在污染条件下具有更高丰度，与杨树NPF 5.4,3.1和5.2蛋白具有紧密同源性。三种不同的海藻糖-6-磷酸合成酶转录物是差异表达的，在污染土壤中培养的根中均具有较高的丰度。虽然海藻糖合成在植物中的作用有些模糊，但海藻糖是菌丝中的主要储存碳水化合物并且涉及ECM非生物胁迫耐受性。此外，糖转运蛋白SWEET2在受污染土壤的根中具有较高的丰度。SWEET仅在最近才被鉴定，但已经强烈地涉及植物真菌相互作用，包括由AMF定殖的马铃薯根。在拟南芥中，已显示SWEET2在根毛，表皮以及与根际紧密接触的细胞中积累。有趣的是，作者认为SWEET2可作为双向葡萄糖转运蛋白，通过限制/液泡负荷控制葡萄糖分泌，这是与根际微生物高度复杂和协调相互作用的一部分。
2.5 群落组成
来自未污染土壤的旱柳根中最丰富的下调重叠群编码两种不同的特异性S2蛋白（图2）。虽然这些蛋白质功能未知，但已发现它们在藜苜蓿1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合成酶2敲除中被下调，这也减少了AMF根的定植。酸性内切壳多糖酶在污染处理的根中上调。虽然这直观地与植物对病原真菌的防御有关，但许多研究发现这种内切壳多糖酶可以促进与真菌的共生关联，建议的作用方式是非真菌破坏的质外体几丁质酶修饰外生菌根诱导子以促进共生。旱柳根差异表达反映了植物对外来分子模式的识别，效应物的非识别影响以及已知由于真菌相互作用而显着改变的营养物交换和水可用性的改变。
图2：差异表达的重叠群的起源。a：所有重叠群（包括非差异表达）和b 仅差异表达重叠。c：Viridiplantae，Fungi，Metazoa，Bacteria和Unknown（未知的相似序列）注释的差异表达重叠群的图。d：所有差异表达重叠群在Krona图中的表示。
图3 ：旱柳差异表达转录组分布和丰度。
3.真菌
3.1 分类学
真菌代表了根样本中污染的多样化，是8252个不同差异表达重叠群的注释来源。注释为真菌的重叠群具有与污染相关的非常明显的图案;在两种条件下存在的重叠群中，88.8％在未受污染的树木中具有较高的丰度，而与之相反，仅在一种条件的树木中存在的重叠群中，96.3％处于受污染的条件下（图2b，c; 4a）和5）。甚至在研究基因功能之前，这些表达模式可以被解释为由于污染导致的真菌组成型表达的一般下调以及可能的独特群落组成。相比之下，只有7个旱柳差异表达重叠群仅在单一条件的树中表达。
在差异表达转录物中最代表的两个子囊菌属物种是密切相关的，烧土火丝菌（Pyronema omphalodes）和黑冬松露（Tuber melanosporum）（图4b）。这些物种都主导了真菌的差异表达，并具有足够高水平的初级注释重叠群。在非污染树木的根部，转录水平几乎更加丰富。与子囊菌不同，担子菌的表达在污染方面是动态变化的，因为三个密切相关的物种Heboloma cylindrosporum，Galerina marginata和Hypholoma sublateritium注释的1639个重叠群被下调，而具有高度独特的表达模式的1745个重叠群被上调（图4c）。这些上调的重叠群在注释起源的极端多样性方面是独特的，并且大部分（71％）仅存在于受污染土壤的根中。
3.2 二级注释
通过利用二次注释，阐明经常被忽视的注释中的模糊性，可以将所有差异表达重叠群分配给有机体。因为由于污染，担子菌广泛地支配了增加的表达（图4a-d）。担子菌的二级注释广泛分布在Agaricomycotina上用于上调的重叠群，而下调的重叠群（> 95％）来自包含三个密切相关的属的特定的进化树（图4c），其他不同的（图4d）上调的担子菌门，二级注释显示在我们的Agaricomycotina内的重叠群中没有主要的注释来源。
图4：真菌差异表达和二级注释的分类.a：来自真菌与子囊菌和担子菌的注释的差异表达重叠群，b：注释突出的差异表达子囊菌重叠群和c：差异表达担子菌重叠群。d：每个差异表达真菌重叠群的二级注释。
3.3 上调的担子菌基因功能
菌根真菌的复杂程度非常高;一旦差异表达基因被注释，进一步根据担子菌注释进行亚注释，甚至进一步根据对污染的反应进行选择，1745 差异表达注释的转录组用于描述潜在功能。在这1745个差异表达转录组中，70％具有未知功能，并且被注释为来自担子菌亚种的假定或未表征的蛋白质。就可识别的基因功能而言，在污染条件下表达的最丰富的真菌重叠群是质膜蛋白脂质3（Pmp3），注释为Moniliophthora。Pmp3在真菌中高度保守，是环境应激诱导的，参与细胞毒性阳离子耐受性和鞘脂合成，因此可能与污染条件的膜完整性维持有关。通常，独特的担子菌群中最高表达的重叠群（图4c和5）与碳氢化合物降解无关，而是与经典的植物根系和/或高度上调的细菌相关，即碳水化合物输入，氮代谢和运输，以及细菌相互作用。
图5：担子菌门差异表达转录物分布和丰度。上图：被污染和未受污染的差异表达基因的变化分布。中间：平均值与每个差异表达重叠的倍数之间的差异。
4. 细菌
4.1 细菌中的聚腺苷酸化（polyA）
一些研究已经确定聚腺苷酸化在细菌物种的mRNA降解和RNA质量控制中的潜在参与。在植物转录组学中，polyA富集过程中细菌mRNA的未知绝对比例可能会丢失。尽管polyA富集，但观察到极其广泛的细菌多样性（图6a）。来自变形菌门，放线菌，拟杆菌和厚壁菌门的这些重叠群的大部分也被高度代表。在差异表达重叠群中辨别出不同的图像（图6b），在638个差异表达重叠群中，86％的受污染树木的丰度较高。肠杆菌科物种代表性最高，注释了所有细菌重叠群的72％。100％的肠杆菌科重叠群在受污染的树木中具有更高的丰度（图2b，c），表明与污染和/或其他生物的强烈生物学联系。
图6：细菌重叠群，总和和差异表达的转录物来源。
4.2 解码多顺反子转录单位
在注释为细菌的639个差异表达和潜在的多顺反子重叠群中，使用转码器鉴定了3134个蛋白质编码区。总共有489个这样的重叠群被鉴定为肠杆菌科。这些可以代表来自单个生物的不同生物或多个操纵子的共同表达。2834种肠杆菌科推测的蛋白质中的大多数是从大肠杆菌或志贺氏菌属。
4.3 上调的细菌基因功能
重叠群c596278_g1_i5上调，功能上包括ABC转运蛋白，α-酮戊二酸依赖性双加氧酶（alkB），调节蛋白，硫胺素生物合成脂蛋白（apbE）和苹果酸：醌氧化还原酶（mqo）（图7）。除此之外，许甲苯耐受性的基因是差异表达的，包括假定的操纵子，其含有甲苯转运蛋白亚基mlaCDEF和编码脂多糖输出系统的kdsCDlptACkdsCD。烷基磺酸盐的降解确定为涉及原油降解，通过脱磺酸作用发生并依赖于操纵子ssuABCDE的表达，该操纵子包含链烷磺酸转运蛋白亚基，假定的链烷磺酸转运蛋白亚基，FMNH（2）依赖性链烷磺酸单酯氧化酶，假定的脂肪族磺酸盐结合蛋白和NAD（P）H依赖性FMN还原酶。ssuABCDE操纵子被组装并且差异表达在污染条件下具有更高的丰度。正如在ssu系统预期的那样，相关的tau系统也在含有tauAB蛋白和tauCD的两个独立的假定操纵子内被上调。这些氧化机制，例如众所周知的烷基磺酸单加氧酶ssuD，表明与柳树根相关的细菌物种正在表达能够降解污染土壤中存在的碳氢化合物的酶，因此可能在任何一种中发挥重要作用。
发现三种生物表面活性剂所必需的基因在原油污染土壤的宏基因组研究中表现最多：海藻糖脂质，多元醇脂质和单/二- 鼠李糖脂。参与海藻糖降解途径的主要酶是差异表达的，具有两个假定的操纵子，第一个含有treAdhaLKMR，来自大肠杆菌，第二个含有treF和转录调节因子yhjB。整个rmlABCD操纵子（c433320_g1_i1）在受污染的条件下具有更高的丰度，包括在大肠杆菌中产生鼠李糖脂所必需的L-鼠李糖合成基因。除此之外，鼠李糖-1-磷酸醛缩酶（rhaD），鼠李糖激酶1（rhaB）和鼠李糖异构酶（rhaA）都被上调，允许从二羟基丙酮磷酸盐提供L-鼠李糖，存在于包含rhaDyiiL和PTS基因的两个操纵子中。尽管认为L-鼠李糖合成途径已被充分表征，但鼠李糖脂的3-羟基脂肪酸前体不太确定，尽管已假设II型脂肪酸合成途径和β-氧化都可提供脂质前体。操纵子（c601578_g3_i4）含有许多II型脂肪酸合成途径（FAS-II）成员：fabDFHychHyceDFGthiK。然而，未检测到rhlAB，其可识别为驱动铜绿假单胞菌中的鼠李糖脂，并且含有fabA的操纵子，可能是β-羟基癸酰基-ACP的竞争作用。对于β氧化，两种fadIJsixA上调的操纵子（c591107_g2_i1和c591107_g2_i2），如果是大肠杆菌K-12，则是常见的操纵子，在污染条件下具有更高的丰度。fadIJ最近在大肠杆菌中发现了β-氧化fadAB的同源物，建议优选短链和中链脂肪酸降解。
图7：在受污染树木的根部中选择的差异表达的细菌假定操纵子具有更高的丰度。
结 论
仅从基因表达，旱柳的主要反应似乎不是直接降解，固定或排除污染物，而是与微生物群相互作用的广泛，极其复杂的变化。生物信息学方法揭示多样化的真菌群落，对基因表达的变化以及群落构成的显着变化动态响应污染。真菌基因表达主要受与微生物组相互作用相关的途径改变的支配。代表增加的石油烃代谢的基因表达来自肠杆菌科，其总表达在受污染树木的根中均匀地更丰富。
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