科研 | 内蒙古农大张和平： 口服复方益生菌改善犬的采食量、增重、免疫力和肠道菌群结构
本文由张帆编译，玛莉、江舜尧编辑。
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益生菌已被成功地用于促进人类和动物的健康，但对利用益生菌改善不同年龄寄主健康的研究还很少。由于犬肠道菌群结构和功能与人相似，因此犬微生物群落的研究可以预测人类的研究结果。在本研究中，根据犬龄将90只犬随机分为3组：老年组30只，青年组24只，训练组36只。每组内实验组连续20天食用含3株益生菌复合物的食物，收集服用益生菌的第0天、30天、60天和停止益生菌摄入后15天的血清和粪便样品。结果表明，益生菌显著提高了老年犬组的日均饮食摄入量和所有犬的日均增重量，提高血液IgG、IFN-α和粪便SigA水平，同时减少TNF-α。此外，益生菌可以改变犬肠道菌群结构，老年犬对益生菌的反应最强烈，食用益生菌显著增加有益菌，并减少潜在的有害细菌；其中一些物种的相对丰度与某些免疫因子和生理参数相关，提示益生菌通过调节犬肠道菌群刺激抗体和细胞因子分泌，改善宿主健康，增强宿主免疫力。此外，在食用益生菌的第60天，老年犬的肠道菌群结构趋向于更年期的个体。本研究结果表明，益生菌对犬的健康和免疫的作用与年龄有关，并为未来益生菌改善动物和人类健康策略的发展提供了有趣的见解。
论文ID
原名：Oral Administration of Compound Probiotics Improved Canine Feed Intake, Weight Gain, Immunity and Intestinal Microbiota
译名：口服复方益生菌改善犬的采食量、增重、免疫力和肠道菌群
期刊：Frontiers in immunology
IF：5.511
发表时间：2019年
通信作者：张和平
通信作者单位：内蒙古农业大学
实验设计
1 实验动物
不同年龄的犬90只，分为三组老年组（60-156月龄，n=30），青年组（＜8月龄，n=24）和训练组（9-24月龄，n=36），每个分组分为2个亚组，分别为益生菌治疗组和对照组。在整个研究期间，所有对照亚组每天三次喂食基础饮食。所有益生菌治疗组均根据体重和年龄喂养基础日粮，补充适量的复方益生菌，连续60天。在研究之前和研究期间，没有一只狗有抗生素使用史或已知影响肠道微生物群的任何其他药物至少3个月。
2 样品采集
在实验益生菌的第0天、30天、60天和停止益生菌治疗的第15天，收集新鲜粪便样品和血清样品。
3 基础生理参数和免疫标记的测定
在7个其他时间点（即治疗的第3，7，15，30，45和60天以及停止益生菌治疗后第15天）监测每只狗的腹泻症状，腹泻的严重程度分为零，轻度，中度和严重。在基线水平（第0天），第30天，第60天和在停止益生菌使用的第15天监测所有血清，分析白细胞，淋巴细胞和中性粒细胞；同时，采用ELISA的方法测定血清中免疫球蛋白G（IgG），肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-6（IL-6）和干扰素-α（IFN-α）的浓度以及粪便中分泌性免疫球蛋白A（SIgA）浓度。
4 肠道微生物群的评估
提取粪便样品基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度分析（260nm / 280nm处的光密度比）验证提取的基因组DNA的质量。PCR扩增，16S rRNA基因测序，构建DNA文库，提取的高质量序列进行生物信息学分析。评估序列深度和生物多样性丰富度、不同样品中的微生物群结构以及各因素在塑造肠道微生物群结构变化中的重要作用。
5 益生菌对老年犬肠道菌群年龄指数的影响
在益生菌治疗开始前的第0天建立了基于所有90只狗的OTU水平微生物群概况的年龄预测模型。通过随机森林回归模型进行计算，根据“特征重要性”（即年龄）对所有属进行排序，较高的肠道微生物群年龄指数代表“较老的”微生物群。益生菌治疗后第30天，第60天和停止益生菌摄入后第15天与第0天的组（基线水平）进行比较，确定不同年龄分组犬肠道菌群年龄指数的变化，评估益生菌对老年犬肠道菌群的影响。
6 统计分析
所有统计分析均使用R编程语言（版本3.1.3）进行。检测不同样品之间在门、属和种水平的物种丰度差异，P值<0.05具有统计学意义。此外，每个系统发育水平的粪便细菌比例独立比较，利用Spearman等级相关系数评价粪便细菌与免疫指标的相关性，构建网络图。
结果
1 益生菌对宿主健康状况的影响
首先，我们观察了益生菌治疗对宿主健康的影响。使用益生菌组和对照组之间的呼吸频率，脉搏率，体温和白细胞（包括淋巴细胞和中性粒细胞）计数，无显着差异（图1A-C，表S2），表明使用益生菌没有对宿主造成任何可观察到的不良生理影响，对犬使用是安全的。在益生菌治疗过程之前和期间评估所有狗的腹泻症状（图1D，E）。在干预结束时，接受益生菌的狗腹泻的比例显着低于实验前（P<0.0001）。益生菌的使用显着降低了实验组犬在第30天和第60天的临床评分，即腹泻症状（与非治疗对象相比）；症状缓解效果持续至停止益生菌使用后15天。此外，自治疗开始以来，使用益生菌犬的腹泻临床评分显着降低。这些结果共同证明了益生菌治疗在减轻腹泻方面的功效。
研究结果显示使用益生菌对犬采食量和体重增加起到促进作用。在益生菌使用第30天（相对于第0天）后，青年组和训练组犬的ADFI显着增加（分别为P <0.05和P <0.01）。与对照组相比，使用益生菌的老年犬，ADFI在第30天显着增加（P <0.05）（图1F）。在第30天和第60天之间，使用益生菌使三个分组犬的ADWG显着增加（老年组犬和青年组犬P <0.05，训练组犬P<0.001）。此外，值得注意的是，在使用益生菌第60天与停止使用益生菌第15天之间，接受益生菌的老年犬体重增加显着性更高，表明这种效果是持久的（图1G）。
图1 益生菌对宿主健康的影响。三个样本组（老年组、青年组和训练组）的呼吸频率（A）、体温（B）和脉搏（C）；（D）使用益生菌第0天和第60天腹泻犬的比例；（E）对照组和益生菌治疗组腹泻严重程度的变化。误差条表示SEM。“***”代表益生菌治疗组在不同时间点的比较，***P < 0.001；“#”代表益生菌治疗组和对照组在相同时间点的比较，#P＜0.05。不同年龄分组犬的平均日采食量（F）和平均日增重（G）。在第0，30，60和15天（AC）（停止益生菌处理后15天）监测参数，* P<0.05，** P <0.01，*** P <0.001。
2 益生菌改善犬的免疫应答
为了研究益生菌对宿主免疫的影响，监测血清IFN-α、IgG、IL-6和TFN-α水平，以及粪便SIgA水平。在第60天，训练组犬血清IFN-α水平显着增加（P<0.05）（图2A）。在益生菌给药期间和停药后15天，对于所有不同年龄组的犬，益生菌治疗组血清IgG和粪sIgA水平显著高于相应的非治疗对照组和第0天的基线水平（图2B，C）。然而，益生菌的使用并未导致各年龄组犬血清IL-6水平发生显着变化（图2D）。与对照组相比，在第60天使用益生菌的老年组犬和训练组犬血清TFN-α水平显着降低，而对于幼犬而言，无论是否使用益生菌均为观察到显着效果（图2E）。最后，与训练组相比，老年组犬粪便SIgA水平、血清IgG水平和IFN-α水平明显降低（图2A-C）。
图2 益生菌治疗对犬免疫指标的影响。老年组、青年组和训练组犬血清IFN-α水平（A）、血清IgG水平（B）、粪便分泌IgA（SIgA）水平（C）、血清IL-6水平（D）和血清TFN-α水平（E）。第0、30、60和15（AC）天（停止益生菌治疗后15天）监测各项指标。*P<0.05，*P<0.01，*P<0.001。
3不同年龄犬肠道菌群的差异
虽然本研究数据表明益生菌对犬的健康有改善作用，但益生菌是否会影响肠道微生物群，从而调节宿主的健康。通过16S rRNA测序，质量过滤后，代表性细菌OUT序列的总数为592,204（表S3）。α多样性分析，评估物种的丰富度和多样性（表S3），这些值表明多数样品均表现出较高水平细菌生物多样性。
首先，为了确定宿主因素（即品种、性别、腹泻严重程度和年龄）对犬肠道菌群的影响，根据OTU水平的Weighted UniFrac距离进行PERMANOVA检验。发现犬的年龄是影响肠道菌群结构的最重要因素（F = 6.36，P = 0.001），其次是腹泻的严重程度（F = 1.87，P = 0.037）。犬的品种（F = 1.84，P = 0.11）和性别（F = 1.10，P= 0.32）对粪便微生物群的形成影响不显著（图3A）。第0天90只犬肠道菌群的整体结构在三组之间存在显着差异（F = 6.36，P = 0.001）（图3B），反映了不同年龄的犬肠道菌群结构不同。然后使用LEfSe分析鉴定不同年龄组差异丰度较高的细菌（图3C）。与青年组犬和训练组犬相比，老年组犬的Fusobacterium perfoetens和 Fusobacterium varium明显更多。在青年组犬中检测到更多的链球菌、Rptobacillus russellii和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。对所有训练犬而言，与青年组犬和老年组犬相比，训练组犬拟杆菌属（Bacteroides）和动物乳杆菌（Lactobacillus animalis）均显着富集。
图3不同年龄犬肠道菌群的差异。（A）犬的品种、性别、腹泻严重程度和年龄对肠道菌群结构的影响，显示了组内和组间变化的结果。（B）基于Weighted UniFrac距离的犬主坐标分析（PCoA）评分图。（C）LEfSe分析老年组犬、青年组犬和训练组犬之间存在差异丰富的细菌。LDA截止分数为4。
4益生菌对肠道菌群多样性和结构的影响
在使用益生菌期间，不同年龄犬的肠道菌群多样性和丰富度的变化分别由Shannon指数和Chao 1指数表示（图4A）。对照组和益生菌组之间的Shannon指数和Chao 1指数在实验中没有显着差异（P > 0.05）。然而，在使用益生菌的第30天，接受益生菌的老年组犬（P = 0.066）和训练组犬（P = 0.07）肠道菌群（Chao 1）指数丰富度略高于对照组。基于OUT水平的Weighted UniFrac距离，主坐标分析（PCoA）研究了犬使用益生菌肠道菌群结构的变化（图4B-D）。对于老年组犬而言，在第60天观察到益生菌治疗组和对照组肠道微生物结构均有明显差异（P=0.025），F=2.53），即使停止使用益生菌后15天（P=0.01，F=3.20），两组肠道菌群结构仍有显着性差异（图4B）。然而，在整个实验过程中，益生菌组与对照组肠道菌群结构无显着性差异（图4C）。此外，青年组犬在使用益生菌的第60天（P=0.082，F=1.97）和停止使用益生菌后的第15天（P=0.075，F=1.97），益生菌组与对照组略有差异（图4D）。肠道菌群分析结果表明，在益生菌的应用中，不同年龄犬肠道菌群结构的变化是不同的，特别是老年犬肠道菌群结构变化更为明显。因此，将进一步探究肠道菌群组成的变化是否与年龄有关。
图4益生菌对肠道菌群多样性和结构的影响。（A）益生菌对犬肠道微生物α多样性的影响。使用益生菌的第0、30、60天和15（AC）（停止使用益生菌后15天）的老年组犬（B），青年组犬（C）和训练组犬（D）的主要坐标分析（PCoA）。F值和P值表示两组的差异。
5 益生菌对肠道微生物组成的影响
为了评估益生菌的使用如何影响犬肠道菌群结构，比较了各时间点对照组和益生菌治疗组在属和种分类水平的细菌相对丰度（图5A-E）。在属分类水平上，青年组犬在整个实验过程中细菌相对丰度变化不显著。然而，在物种分类水平上，与训练组犬和青年组犬相比，老年组犬的肠道微生物多样性和结构发生了更明显的变化。研究人员观察到肠道菌群结构和组成随着宿主年龄的增长而变化。例如，使用益生菌使Bacteroides和Faecalibacterium prausnitzii相对丰度显著增加，而对肠道产生不良影响（Blautia）的物种得到抑制。
图5益生菌对肠道微生物组成的影响。老年组犬（A）和训练组犬（B）差异细菌属的平均相对丰度。老年组犬（C）、训练组犬（D）和青年组犬（E）中通过益生菌治疗调节的差异丰富细菌物种的热图（相对丰度至少在一个时间点上发生了显著变化）。*P<0.05，***P<0.01，***P<0.001。
6益生菌对肠道菌群年龄指数和组成的影响
由于年龄是塑造犬肠道菌群结构的重要因素，也是老年组犬的肠道菌群结构改变更明显的重要因素，我们通过随机森林回归模型进一步描述了益生菌对老年组犬肠道菌群老化状态的影响。该模型回归了所有检测到的分类群相对于犬年龄的相对丰度（图6A）。根据回归结果，确定了20个年龄标记属（图6B）。基于这20个标记属的组成，在第0天计算每个样品组的肠道菌群年龄指数。肠道菌群年龄指数的低值表明“年轻”肠道菌群结构。正如预期的那样，第0天的老年组犬、训练组犬和青年组犬的肠道菌群年龄指数按降序排列。有趣的是，60天的益生菌治疗将老年组犬的肠道菌群年龄指数明显下降，接近于训练组群的基础值。然而，这种效果在停止益生菌治疗后15天逆转（图6C）。
图6益生菌对肠道微生物群年龄指数和组成的影响。（A）以犬的年龄回归的输入属级别分类的数量函数，按重要性变化的顺序。（B）由随机森林回归确定的20个优势细菌标记属。（C）根据随机森林模型预测，在第0、30、60和15天（AC）（停止益生菌治疗后15天）（通过蓝线连接）使用益生菌的老年组犬肠道微生物群的年龄指数。每个点代表一只狗肠道菌群年龄指数。棕色线代表不同年龄组犬肠道菌群年龄指数的基线水平（第0天）。
7 益生菌对犬采食量、体重和免疫指标相关细菌的影响
为了研究益生菌对肠道菌群的影响是否与改善犬的健康状况和提高免疫能力有关，采用Spearman秩相关分析方法研究了不同年龄犬的ADFI、体重或免疫因子与差异菌群之间的相关系数（图7）。结果表明提示肠道菌群可能与犬的ADFI、ADWG和免疫有关，益生菌可能通过调节肠道某些特定的细菌来改善犬的健康和免疫。
图7益生菌对犬采食量、体重和免疫指标相关细菌的影响。网络图显示了差异细菌与采食量、体重、免疫指标在老年组犬（A）、训练组犬（B）和青年组犬（C）中的相关性。蓝色圆圈和红色菱形分别代表显着相关的细菌和生理指标（采食量，体重，粪便分泌型IgA，血清IgG，IFN-α，IL-6和TNF-α）。红色菱形的大小代表于显着相关细菌的丰度。细菌与免疫因子，采食量，体重之间的显着相关性通过曲线连接; 曲线的颜色表示相关程度。正、负Spearman's Rho分别代表正相关和负相关。
评论
此文中，利用复合益生菌有效改善犬的采食量、增重量、免疫力和肠道菌群结构，使有益菌显著增加，有效减少潜在的有害细菌。同时，揭示了肠道菌群结构的变化与年龄有关。由于犬肠道菌群结构与人相似，该研究结果对益生菌的应用及开发以改善健康提供了新视角。
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