编译：逍遥君，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
土壤被认为是最具生物多样性的生态系统类型之一，但其微生物多样性的许多特征仍然未知。由于土壤环境的异质性，原位研究土壤微生物具有挑战性。因此，陆地栖息地仍然是未开发的遗传和代谢多样性的巨大储藏库，微生物群落中编码的基因和代谢多样性驱动着重要的生态系统水平的过程，包括氮循环和二氧化碳通量。因为土壤含有3000微克的碳，并有可能成为碳源，被认为是全球健康的关键，对气候变化也很重要。因此，有必要对土壤微生物多样性进行表征，以便更好地了解生态系统在快速环境变化中的功能和恢复力。
高通量测序技术与新的宏基因组结合算法使解析基因组的宏基因组学研究成为可能，大大扩展了未培养类群的参考基因组的可用性。从土壤微生物群落直接测序的最新应用使人们对土壤微生物的分类学和功能潜力有了更广泛的认识。然而，在高度多样化的环境中，宏基因组学可能只捕捉到最丰富的。此外，宏基因组学检测到的数据还可能包括来自死亡微生物的细胞外的外源DNA，这种外源性DNA的存在有可能扩大多样性和基因组潜力的估计。在测序过程中，分离细胞和外源DNA可以更准确地估计微生物多样性。微型宏基因组学分析目前仅用于水环境，包括温泉、医院水槽生物膜和活性污泥。微型宏基因组学比单细胞基因组学具有更高的测序量，与大型宏基因组学相比，微型宏基因组学可以对土壤群落的不同成分进行研究，包括可以从颗粒中分离的细胞，以及对单细胞裂解步骤敏感的细胞。使用两种重叠的元基因组学方法可以使我们获得比仅使用一种方法本身更广泛的分类学多样性。本研究结合了微型宏基因组学和大型宏基因组学以获取更全面的土壤微生物群落多样性。研究结果发现了一些目前尚未分类的类群，从而为已知的主要土壤分支和未被研究的分类学类群的多样性做出了贡献，可作为今后研究的参考序列。
原名：Complementary metagenomic approaches improve reconstruction of microbial diversity in a forest soil
译名：补充的宏基因组学方法对森林土壤中微生物多样性重建的完善
期刊：mSystems
IF：6.633
发表时间：2020.03
通信作者：Tanja Woyke
通信作者单位：加州伯克利大学联合基因组研究所
本实验从位于美国马萨诸塞州的哈佛森林长期生态研究所的Barre Woods实验田收集了土壤样本。该地点由两块30×30米的地块组成：一块正常土壤温度，另一块自2002年以来使用埋在10厘米深度的加热电缆人工加热。在长期实验过程中，已经测量了土壤呼吸，氮矿化，植被覆盖和生长以及土壤和垃圾的化学性质。林冠层的过度活动主要由纸桦树和黑桦树（分别为桦木和桦木），红枫树，黑橡树和红橡树（分别为栎栎和Q栎）和美洲山毛榉为主。从30×30米的试验区中随机选取了两个完整的土壤。通过目测将收集到的土壤核心分为有机层（大约5 cm的土芯）和矿物层（下部5 cm的土层），并用2毫米孔径的筛网筛分，最终得到4个土壤样本。通过比较微型宏基因组和大型宏基因组两种方法对土壤中微生物的覆盖程度，评估方法的优异，并对土壤微生物多样性选用何种方法做出评述。
为了将复杂的土壤群落划分为许多更小、更简单的亚群，本实验改进了微型宏基因组学检测设备，即结合了微生物细胞分类和宏基因组测序。从哈佛森林长期生态学研究所的Barre Woods温室试验田收集了四份土壤样本。每个样本对90个含有100个细胞的复制池进行测序，共得到微型宏基因组359个（一个微型宏基因组未达到质控标准）。按照微型宏基因组测序相同的操作，对四个土壤样本进行大型宏基因组学研究，分别产生1.2 Gbp和1.3 Gbp的数据（图1）。
图1微型宏基因组和大型宏基因组方法的概述。（A）微型宏基因组检测了四个土壤样本，其中包括一个加热处理后的表层土壤样本、一个加热处理后的下层矿物土壤样本、一个对照表层土壤样本和一个对照的下层矿物土壤样本（n=4）。使用涡流将温和的洗涤剂和土壤混合，然后离心、过滤，并通过孔径大小为5 μm的过滤器得到土壤中的细胞样本。
（B）大型宏基因组检测样本与微型样本相同。（C）提取核酸后，制备文库并进行鸟枪测序。所得序列经过组装和质控。
使用上述方法共得到1793个sorted-MAGs和275个bulk MAGs（图2）。使用质控（完整度≥50%，污染≤10%，应变异质性≤10%）处理后，得到合格的微型集合宏基因组200个和大型集合宏基因组29个。MIMAG标准认为完整性低于50%的MAG质量较低，因而在本研究中将其排除在分析数据之外。总的来说，质控在完整性的基础上去除了质量较低的sorted-MAGs，而去除的bulk MAGs由于污染和均质程度差。质控结果显示，中等质量的bulk MAGs（81.5%）的平均完整性高于中等质量的sorted-MAGs（61.9%）（n=200；P=3.29×10-7，图2）；bulk MAGs的平均污染水平（1.92%）高于sorted-MAGs（0.98%）（P=0.01117，图2）；bulk MAGs的平均异质性水平（1.16%）高于sorted-MAGs（0.04%）（P=3.89×10-6，表S2）。上述结果表明，微型宏基因组可以将较少的菌株整合为单个MAG，从而达到较低的菌株异质性。
图2 代表的sorted-MAG和bulk MAG质量的评估。代表四个样本的sorted-MAGs（橙色，n=1793）和bulk MAGs（蓝色，n=275），根据CheckM标记基因分析，中等质量的sorted-MAGs（深橙色，n=200）和bulk MAGs（深蓝色，n=29），筛选条件是≥50％的完整性，≤10％的污染和≤10％的菌株异质性。每个圆圈的大小代表每个MAG中16S rRNA基因拷贝的数量。
序列中GC含量可作为比较微型宏基因组学和大型宏基因组学的一种方法，结果显示，sorted-MAGs和bulk MAGs的平均GC含量分别为49.2%和60.5%（图S1）。GC含量的差异可能是由于单细胞分选工作流程中的偏差，例如细胞对分选和裂解的敏感性以及在多重置换扩增期间引入的扩增偏差。微型宏基因组使用的细胞分离方法减少了外源DNA导致的群落多样性膨胀。另外，微型宏基因组和大型宏基因组之间的DNA提取程序存在差异，每种方法都可能会得到采样区不同的微生物组成部分，进而可以得到更多样的微生物。综上所述，微型宏基因组和大型宏基因组产生了大量高质量的MAG，这些MAG可用作基因组解析研究中广泛的微生物多样性的补充数据集。
本研究的目的之一是提供代表土壤微生物多样性的参考基因组。在先前发表的土壤细菌和古生菌基因组的背景下，评估了sorted-MAGs和bulk MAGs对系统发育多样性的贡献。使用已质控得到的200个sorted-MAGs、29个bulk MAGs和3024个土壤微生物参考基因组的级联标记基因得到了系统发育关系（图3A）。按照平均核酸同一性为95%为划分物种的阈值对序列进行统计，得到170个sorted-MAGs、25个bulk MAGs和2341个参考MAG（图3A）。聚类的结果显示MAG数量减少较少，表明此前的MAG与可用参考序列之间的冗余非常小。此外，sorted-MAGs和bulk MAGs代表了众多的土壤进化分枝的基因组多样性，包括Alphaproteobacteria（16个sorted-MAGs，2个bulk MAGs）、Acidobacteria（11个sortedMAGs，14个bulk MAGs）和Planctomycetes（2个sorted-MAGs，1个bulk MAG）。sorted-MAGs和bulk MAGs也代表了丰度较低土壤物种的多样性，包括TM6（6个sorted-MAGs，1个bulk MAG）和Betaproteobacteria（3个sorted-MAGs，1个bulk MAG）。
图3 本研究确定了土壤分类单元的系统发育多样性。（A）在先前排序的土壤分类单元中，中等质量的sorted-MAGs和bulk MAGs的系统发育的最大似然树。彩色的分支代表包含sorted-MAGs和/或bulk MAGs的进化枝。橙色分支仅包含sorted-MAGs，蓝色分支仅包含bulk MAGs，绿色分支同时包含sorted-MAGs和bulk MAGs。橙色的数字表示贡献的sorted-MAGs的数量，蓝色的数字表示bulk MAGs，灰色的数字表示每个进化枝中参考序列的数量。（B）通过sorted-MAGs和bulk MAGs进行系统发育多样性扩展。灰色代表IMG数据库中土壤参考序列贡献的总分支长度。橙色条表示来自sorted-MAGs的总分支长度，蓝色表示来自bulk MAGs的分支长度。每个栏旁边显示了这项研究中系统发育多样性增加的百分比。
通过比较微型宏基因组和大型宏基因组包含的MAGs显示出土壤细菌和少数古细菌类群的多样性，并证明了这两种方法在检测方面的互补性。sorted-MAGs检测到先前发现的在整个土壤类型中大量并普遍存在的类群的多样性，以及被认为是稀有生物圈的一部分的类群，该物种可能仍然广泛存在，但在微生物群中的丰度相对较低。在sorted-MAGs中高丰度的分类单位包括Bacteroidetes（n=48）和Verrucomicrobia（n=8），而在土壤中典型的低丰度的分类单位包括Thaumarchaeota（n=4）、Omnitrophica（n=3）、Ignavibacteria（n=2）、Melainabacteria（n=1）和Firestonebacteria（n=1）。许多sorted-MAGs属于门，通常由病原体和共生菌组成，例如Chlamydiae（n=1）和Gammaproteobacteria，特别是Legionellales目（n=30）以及TM6（n=7）（图3A）。Chlamydiae门和Gammaproteobacteria门内的Legionellales目的基因组完全存在于细胞内。通过sorted-MAGs鉴定的菌群除了在稀有生物圈外还有先前土壤群落研究中发现的丰富的类群，这表明微型宏基因组可用于将多样性扩展到丰富的土壤类群之外（图3）。bulk MAG中包含一些罕见的类群，这些类群通过微型宏基因组无法得到，其中包括WPS-2（n=3），Euryarchaeota（n=1）和Saccharibacteria（n=1）。为了确定sorted-MAGs对已知微生物多样性范围的贡献程度，本研究由系统发育树内目标序列贡献的分支长度的总量进行评估。计算结果表明，相比于IMG/M的土壤参考序列，sorted-MAGs的总分支长度增加了7.2%（图3B）。这表明微型宏基因组不仅包含已知土壤细菌和古细菌进化分支内的系统发育多样性，而且包含了通常在森林土壤中发现的候选植物门和低丰度的类群。具体而言，sorted-MAGs增加了熟知的菌群（Bacteroidetes（33.6%）和Alphaproteobacteria（19.4%））的分支长度，以及众所周知的对实验室难以培养的细菌，如TM6（62.1%）、Verrucomicrobia（41.3%）和Acidobacteria（28.0%）。最为显著的是衣原体的系统发育多样性增加（72.5%），这个分类群由于其在土壤中丰度较低且可能依赖于真核宿主细胞，因此在土壤宏基因组研究中通常被忽略。本研究在样本处理过程中应用温和的去污剂和注射器过滤可能已经溶解了作为细菌内共生体宿主的微生物真核生物，从而使这些细菌更易于用于荧光活化细胞分选。这样样本中检测出了16种新巨型病毒可能也有类似的现象，因为这些病毒通常与真核宿主细胞有关。这些细胞内细菌的假说使得微型宏基因组测序成为研究细胞内生命多样性和进化的有力工具。sorted-MAGs证明了微型宏基因组学相比大型宏基因组学所检测出的物种范围更大，能覆盖到更多的物种。bulk MAGs包含许多与sorted-MAGs相同的土壤细菌进化分支多样性，包括Acidobacteria（10.5%）、TM6（6.8%）和Alphaproteobacteria（2.6%）。即使在分支中含有更多bulk MAGs（相比sorted-MAGs），统计结果仍显示sorted-MAGs更加的多样化，如Acidobacteria。由于所使用的参考序列并非均在IMG/M数据库中公开，因此本研究通过增加MAG计算得到的系统发育多样性的增加在一定程度上收到了限制，但是，该数据库可以通过GenBank上更新的数据进行更新。迄今为止，微型宏基因组尚未在土壤检测中得到广泛应用，它将作为扩展我们对土壤生物多样性知识的宝贵工具。本研究中同时应用了大型宏基因组和微型宏基因组，以比较在分析复杂的微生物样本时哪种方法更加优越。比较结果表明，相比大型宏基因组，微型宏基因组可产生更高质量的MAG，这是由于在对选定的细胞进行测序时，菌株水平的异质性相比大型宏基因组低。尽管采用这种方法得到的MAG完整性不如大型宏基因组，但来自土壤的sorted-MAGs显示出更低的菌株异质性，表明来自多个生物体的更少的基因组片段已被折叠成一个基因组区域（表S2）。正如单细胞基因组研究中广泛报道的那样，sorted-MAGs基因组完整性较低部分原因在于全基因组扩增的不均匀性。sorted-MAGs巨大的数量为改进分类学和微生物代谢的基因组研究提供了机会，并将潜在的代谢与生态系统联系起来。鉴于目前缺乏大量的未培养生物的信息，使用高质量的MAGs进行生物分类已经成为扩展微生物生物多样性认知的重要方法。最后，荧光活化细胞分选所使用的样本可以进行改进，以实现更具针对性的细胞和/或群体的分离，从而进一步增加微型宏基因组学检测未知微生物的能力。尽管微型宏基因组学方法较大型宏基因组学产生了更多的中等质量基因组，但这种方法并非没有缺陷。与大型宏基因组相比，由于涉及到可能不易获得的设备和专业知识，微型宏基因组需要研究者具备的知识储备是巨大的。除此之外，包括细胞分离和基于GC的基因组扩增偏斜在内的方法还可能在样品处理过程中产生偏差。细胞外多糖是微生物用来防止环境变化及营养物质交换的一种普遍的策略。这些营养物质可以维持稳定的微生物群落和细胞对土壤颗粒的粘附。在荧光活化细胞分选之前，这些较大的聚集体结构会在样品制备的过程中排除。诸如此类的方法学缺陷可能会反应在本研究的数据中，与传统的大型宏基因组相比，使用微型宏基因组获得的森林土壤中通常丰度较高的生物（如Actinobacteria、Chloroflexi和Firmicutes）数量减少（图3）。尽管由于上述方法上的偏差而丢失了这些类群，但也有可能是因为本研究设置的过滤阈值使得未对来自这些生物体的序列进行分类或将其放置在较低质量的分类中，例如Spirochaetes门中的细菌由47种不同的sorted-MAGs表示，但是这些都没有通过质量过滤标准，因此都被排除在外（图3）。WGA-X是新开发的一种替代的DNA扩增方法，它比MDA改善了细胞裂解和高GC含量生物的扩增。使用这种改进的DNA扩增方法，可能可以弥补微型宏基因组的缺陷。大型宏基因组相比微型宏基因组方法可以更准确地捕获整个土壤样本中的群落。使用大型宏基因组，可以从土壤样本中提取DNA并进行测序，从而避免了通过荧光活化细胞分选造成的部分群落的丢失。因此，大型宏基因组仍然是了解微生物群落尤其是优势土壤微生物多样性的宝贵工具。然而，与bulk MAGs相比，sorted-MAGs可以提供更多的基因组数据，涵盖更广泛的系统发育多样性，从而进一步增加对样本中所含物种信息的发掘。本研究支持使用两种方法相辅相成，以获取最广泛的土壤微生物多样性。4 sorted-MAGs的代表和地球土壤宏基因组的MAGs的对比为了评估陆地生态系统中新生成的土壤可参考的基因组数据，研究人员从80种已知的陆地宏基因组数据和前文筛选到的sorted-MAGs中搜索了编码蛋白质的序列。使用95%核苷酸相似作为同一性的区分标准进行聚类，得到173个sorted-MAGs和28个bulk MAGs（图4）。通过LAST对聚类得到的数据和80个陆地研究的2210个宏基因组数据进行了对比（图4）。我们将具有高度代表性sorted-MAGs和MAGs定义为至少含有200个蛋白质编码序列，并且在70%的对比长度以及95%氨基酸和宏基因组样本相同。
图4 本研究MAGs与陆地宏基因组公开数据的比较。最内层是根据本研究中得到的中等质量的sorted-MAGs和bulk MAGs中56个保守标记蛋白的串联比对建立的最大似然树。通过以95％的平均核苷酸同一性进行聚类，得到173个sorted-MAGs和28个bulk MAGs。进化枝名称根据门进行颜色编码。树木周围的各个轨迹描绘了图例中指定的每种陆地生境类型产生的宏基因组样本对单个sorted-MAGs和bulk MAGs的命中率。条形图的高度指示与宏基因组样本匹配的sorted-MAGs和bulk MAGs编码序列的总数。如果MAGs至少有200个编码序列，且命中率达到95％氨基酸同一性，且与单个宏基因组的CDS的比对长度达到70％，则视为匹配。该图是使用iTOL渲染的。
一些sorted-MAGs和我们在先前对土壤研究检测到的MAGs属于Acidobacteria门（10个sorted-MAGs和15个MAGs）（图4）。在森林、农业、北极、草原和渗流带土壤的宏基因组宏检测出了5个bulk MAGs属于Proteobacteria门，而本研究的样本中检测出2个bulk MAGs属于WPS-2门。并且检测到一种独特的MAG，是此前陆地宏基因组数据库中没有的MAG，经检测属于Planctomycetes。与sorted-MAGs（8.5%）相比，Acidobacteria门是bulk MAGs（77%）中丰度最高的门类（图S3）。而与bulk MAGs（0.1%）相比，Bacteroidetes门是sorted-MAGs（55.5%）中丰度最高的门类（图S3），并且由于Bacteroidetes门的存在，增加了该族系统发育多样性（提高了33.6%）（图3），并且通过与公开的土壤基因组的蛋白质编码序列的匹配发现大部分为新的类群，67种拟杆菌属MAGs仅有6种能够匹配到（图4）。由于目前只有丰度较高的类群才在公开数据库中过多地表述，因而发现的可能不是新类群，而是此前由于丰度较低而没有报道。此外，许多sorted-MAGs和bulk MAGs在此前的哈佛森林宏基因组研究中未被发现。综上所述，我们先前已经发布的宏基因组中包含较低水平的sorted-MAGs（代表Bacteroidetes），通过对比微型宏基因组的检测结果，表明使用微型宏基因组可获得更多样的生物，该方法可用于在系统发生多样性的样本中获得稀有的类群。5 对土壤Bacteroidetes碳代谢的生物学见解Bacteroidetes门约占土壤中微生物总数的10%，我们对该菌门的认识大多来自脊椎动物肠道和水生生物。Bacteroidetes门内Bacteria多参与多糖的降解，然而对于其在土壤中的作用知之甚少。鉴于该现状，并且本研究中67种推定的新型sorted-MAGs对系统发生多样性估计的重大贡献（图5），本研究进一步深入了解它们的生理潜力，并评估与以前已知的Bacteroidetes的功能相似程度。
图5Bacteroidetes门的碳代谢。来自IMG/M数据库的67个Bacteroidetes的sorted-MAGs和70个Bacteroidetes参考序列的串联标记基因树显示了糖苷水解酶和糖基转移酶的进化枝特异性丰度。该进化树的根系是Pedosphaera parvula（Verrucomicrobia门）。A列显示了sorted-MAGs在Bacteroidetes的三个科中的分布，包括Cytophagaceae、Chitinophagaceae、Sphingobacteriaceae，以及一大类未分类的sorted-MAGs。B列显示基因组大小，最深的颜色代表最大的9.1 Mb碱基的基因组，最浅的颜色代表0.6 Mb碱基的基因组大小。C列显示基于CheckM标记基因的基因组完整性，颜色梯度为50％至80.5％。参考序列代表具有完整基因组的分离株。D列显示的基因组GC含量为21.13％至61.24％的颜色梯度。在E到G列中，注释为糖苷水解酶（E列），糖基转移酶（F列）和碳水化合物结合模块（G列）的基因的百分比以条形图的形式显示，垂直线分别表示注释的基因的0％和50％。具有已知共生关系的Bacteroidetes用星号表示。收缩的进化枝包含已知的一种采食树叶昆虫的共生菌Sulcia muelleri和蟑螂的共生菌Blatellabacteriumsp.。
sorted-MAGs的基因组大小在1.6~5 Mb之间（表S4），这包含在此前报道的Bacteroidetes基因组大小范围内，即从0.9 Mb（Cardinium endosymbiont）到9.1 Mb（Chitinophaga pinensis）。发现的sorted-MAGs基因组较小，可能是由于对完整性的估计引起的（图5）。sorted-MAGs主要分为三个不同的科，包括Cytophagaceae、Chitinophagaceae和Sphingobacteriaceae，以及一个未找到对应群类的sorted-MAGs。Bacteroidetes富含大量的编码碳水化合物降解酶的基因，包括广泛的系统发育上保守的糖苷水解酶。本研究中这些细菌类群中CAZy基因家族的分布显示出糖苷水解酶、糖基转移酶和碳水化合物结合模块的进化枝特异性丰度模式（图5）。代表Cytophagaceae科的sorted-MAGs似乎专门用于纤维素的降解，因为它们编码的糖苷水解酶家族5中表现出内切纤维素酶活性的蛋白质。相反，Chitinophagaceae和Sphingobacteriaceae科似乎可利用所有类型的碳，Chitinophagaceae的sorted-MAGs具有降解纤维素，半纤维素和几丁质的潜力。代表Chitinophagaceae的27种sorted-MAGs中有17种含有糖苷水解酶家族18或19中的至少一种几丁质酶、糖苷水解酶家族5、8和9中的纤维素酶以及43家族中可能降解半纤维素和果胶的糖苷水解酶（图5；图S5）。Chitinophaga pinensis（Chitinophagaceae科）的测序基因组包含降解叶片物质和真菌结构的基因，表明其具有降解纤维素和几丁质的能力。代表Sphingobacteriaceae的20几种sorted-MAGs通常具有降解纤维素，木聚糖和几丁质的潜力，其中糖苷水解酶家族2、3、5、13、18和20是该类别中最丰富的。在Sphingobacteriaceae中的一种sorted-MAGs（Q3300020668_2）的糖苷水解酶基因数量最多（125个带注释的糖苷水解酶），代表了各种各样的碳水化合物降解能力和潜在的代谢灵活性。这与先前的描述Sphingobacteriaceae家族能够降解多种多糖的研究相一致。哈佛森林长期生态学研究所的温室试验田得到的土壤检测并推测出的代表新的Bacteroidetes的sorted-MAGs包含了三个不同的科，并且这些科拥有广泛的酶家族，包括参与聚合几丁质、纤维素和半纤维素底物水解的酶家族。这一发现与此前对该区域土壤的宏基因组研究一致。已识别的碳水化合物活性酶基因的数量均随基因组大小的增加而增加（图5；另请参见图S4），说明这些生物体积累了降解各种碳水化合物的能力，利用土壤中碳水化合物从而扩大了它们的生态位。17个sorted-MAGs属于未分类的Bacteroidetes，它们的基因几乎不含糖苷和碳水化合物水解酶，但富含大量糖基转移酶（图5；另请参见图S5），表明这些生物在底物分解中的作用有限，但是其参与糖苷键形成的糖基转移酶基因的相对较高的丰度可能表明这些生物负责较高分子量化合物的合成，并且可能取决于与其他生物紧密结合的生活。为了进一步证明Bacteroidetes在土壤碳降解中的作用，使用KEGG数据库研究了特定碳水化合物的降解，并使用KEGG-Decoder预测了代谢途径的完整性。代表Sphingobacteriaceae和Chitinophagaceae的大多数sorted-MAGs具有几乎完整的编码α-淀粉酶，β-葡萄糖苷酶，几丁质酶和二乙酰壳聚糖二糖脱乙酰酶活性的途径，这进一步支持了这些生物体在多糖降解中的潜在作用（图S6）。另外，在Sphingobacteriaceae中的七个sorted-MAGs几乎包含完整的支链淀粉酶途径。与使用CAZy数据库分析碳水化合物降解潜力相一致（图S5），发现22种sorted-MAGs仅包含一个完整的途径，而没有用于聚合碳水化合物降解的完整途径（图S6）。碳水化合物利用的这种有限潜力与降低的基因组完整性无关（图S4）。相反，本研究认为这些sorted-MAGs具有在土壤环境中的灵活的生存策略，与其他Bacteroidetes所具有的能力相似，包括已知的共生体（CandidatusAmoebophilus asiaticus、Cardinium sp.、Candidatus Sulciamuelleri和Blattabacterium sp.）（图5）。与已知的共生体类似，本研究中sorted-MAGs的平均GC值为39.97％，相对于其他Bacteroidetes序列较低。这些未分类的Bacteroidetes显示出有限的碳利用能力，降低了中心碳代谢和趋化性（图S6），同时平均基因组大小为2.4 Mb，这与先前被鉴定为宿主相关物种的Bacteroidetes相当（图5）。当微生物与共生体接触时，其基因组大小可能会减少，从而导致所含蛋白质编码基因的数量与基因组大小之间存在线性关系。代表Bacteroidetes未分类类群的sorted-MAGs具有相对较低的碳水化合物降解潜力，这可能暗示了这个类群对碳源的要求比较严格。
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