科研| Water Research：在低氧条件下运行的高效MLE-MBR的营养物去除性能和微生物组
编译：gu作成熟，编辑：小菌菌、江舜尧。
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膜生物反应器(MBR)在生活污水处理中的一个关键挑战是其连续曝气控制生物污染时的高能耗。最近，为了减少能源消耗和减轻生物污染，在膜表面施加机械剪切已被引入作为一种替代配置，通过振动、旋转和往复膜运动来实现动态剪切强化过滤。然而，虽然这些方法能有效地降低能源的使用，但对营养物去除效率和微生物群落组成的研究还不够深入。
在本研究中，使用实验室规模的无氧往复式膜生物反应器来表征在缺氧条件下运行的往复式膜生物反应器的微生物组成、功能概况和养分去除情况。微生物群落分析显示，在污泥和生物膜样品中，Proteobacteria(35%)和Saccharibacteria(27%)是最丰富的门。观察到氮和磷的去除效率分别为70％和50％，而化学需氧量减少了约99％。选择性营养去除基因的定量PCR显示，存在完整的氨氧化生物（comammox），平均丰度为1.88x104基因拷贝/克污泥，这解释了尽管标准氨氧化细菌（AOB）的丰度较低，但氨去除率很高。荧光原位杂交显示普遍存在亚硝酸盐氧化细菌(NOB)，其集群远离其他营养物去除菌群，揭示其代谢不依赖氨氧化菌。往复MBR结构可能是一种适合的、更节能的传统空气洗涤系统的替代方案，因为它可以缓解生物污染，并且系统中不同的微生物群落可以实现营养物的去除。
论文ID
原名：Nutrient removal performance and microbiome of an energy-efficient reciprocation MLE-MBR operated under hypoxic conditions
译名：在低氧条件下运行的高效MLE-MBR的营养物去除性能和微生物组
期刊：Water Research
IF：9.13
发表时间：2020.5
通讯作者：Sungwoo Bae
通讯作者单位：新加坡国立大学土木与环境工程系
实验设计
在这个实验室规模的实验中，作者制作并操作了一个改进型的Ludzack Ettinger膜生物反应器。为了启动该实验，将本地废水处理厂的污泥接种到水箱中，并与合成废水混合。合成废水被泵入缺氧池，以0.6 L/h (Q)的流量与葡萄糖混合。合成废水的组成如下：C6H12O6,(NH4)2SO4, KH2PO4, Na2CO3,NaHCO3,MgSO4 andCaCl2。缺氧池通过重力流向好氧池，其流量等于从好氧池到MBR (3Q)和内部循环(1Q)的污泥流量。缺氧和需氧罐都具有机械混合器，以促进均匀混合，并且在需氧罐的底部安装了空气扩散器。3Q泵送至往复式MBR槽，而1Q富含硝酸盐的污泥在内部循环回缺氧槽。污泥以2Q的流量返回缺氧池，以保持MLSS浓度。在缺氧池和MBR池中MLSS的浓度分别达到3 g/L和5 g/L时，污泥才会被浪费，并在此之后一直维持在这个浓度。通过跨膜压力（TMP）的增加来监测生物污染，该压力是使用安装在吸气出口和污水管之间的压力计测量的。为了比较的目的，MP被维持在25 cmHg (0.03 bar)以下，膜操作被维持在20 LMH的通量，在当地一个全面的污水处理设施后。当TMP达到25 cmHg以上时，用水轻轻清洗膜组件以除去滤饼层，并在用高压软管彻底清洗膜之前，手动收集生物膜样品。模块的往复运动是通过将膜盒装在一个机箱中实现的，机箱被机动化来来回移动。同时，从水箱以及系统的进水和出水收集污泥和水样，以进行水质监测和分子实验。之后对污泥和生物膜进行DNA提取，在对其进行qPCR和高通量测序。最后又对污泥进行宏基因组分析以及荧光原位杂交实验。
结果
1 往复式MBR的营养去除性能
表1列出了进水口，水箱和废水中的化学需氧量，氨，总氮和总磷的平均浓度，以及在适应五周后的去除效率百分比（表1）。由于葡萄糖是一种可利用的碳源，在合成废水中作为主要的有机碳源，出水COD浓度下降了约99%。该系统在废水中总氮去除率为8 mg / L，总氮去除率为70％。未氧化氨(NH3的平均值约为7 mg/L)导致出水中TN值较高。通过将有氧水箱中的DO浓度提高到高于本研究中使用的最大DO（2mg / L）的水平，可以进一步降低TN值。同时，在往复式MBR的出水中测出了约50%的初始P含量(~22 mg/L)。
2 低氧系统中的活性污泥和生物膜微生物群落
图1为污泥(n=36)和生物膜样品(n=11)的alpha多样性指数、最丰富的门和属（图1）。污泥样品的alpha多样性指数平均值为8.7±0.7 (Shannon)、 12297±1978 (chao1)、5485±623 (观察到的 OTUs)和203±27 (Faith’s PD)，而生物膜样品的平均值为8.41±0.5(Shannon)、10650±2437 (chao1)、5590±822 (观察到的 OTUs)和160±16 (Faith’s PD)。这些指标表明，在相互作用的MBR系统中，两个类群的物种丰富度、均匀度/丰度、类群数量和系统发育距离都是比较相似的。为了进一步区分两组，图1A中显示了唯一和共享的OTU，其中两种生物类型共享的413个OTU中，只有21个分类单元在生物膜样品中是唯一的，而仅在活性污泥样品中发现了276个OTU。图1B显示了对两组中不同门的更仔细检查。在污泥样品中的54种门中，有81％由5种细菌组成，分别是Proteobacteria（35％），Saccharibacteria（16％），Bacteroidetes（12％），Chloroflexi（12％）和Verrucomicrobia（6％）。来自生物膜样品的43个门中的是糖细菌（27％），变形杆菌（19％），拟杆菌（9％），轻细菌（7％）和绿藻（6％）。在属水平上，污泥和生物膜样品中最丰富的属如图1C所示。在两种生长类型中，未经培养的糖细菌仍是主要属，污泥和生物膜样品中的相对丰度分别约为7％和13％。悬浮群落中以Dechloromonas (1.1%)、Caldilinea(2.4%)和Kouleothrix(5.2%)等参与去除营养的异养生物为主，而未培养细菌GN04(3.4%)和chitinophagaceae (4.5%)是生物膜群落中活跃的主要物种。
图1. A)从往复MBR系统收集的污泥和生物膜样品的OTUs总量和alpha多样性信息的维恩图B）每组的前五个门并分别显示了污泥和生物膜样品中变形杆菌和糖菌占优势C)未培养糖化菌样品中相对丰度最高的20个属。
3 微生物相对丰度与养分去除的关系
为了支持该假设，图3显示了氨和TN去除效率以及硝化螺菌的相对和绝对丰度的图表。如图所示，在MBR操作期间，硝化螺菌的丰度与氨和TN去除效率之间存在很强的关系，这可能支持往复MBR中存在ComammoxNitrospira。该系统中反硝化聚磷生物的存在还有待研究。尽管高相关系数值由先前的研究,它仍然是重要的注意,相关分析的相对丰度营养物去除生物和水质分析本身并不是一个保证预测系统的性能,性能也会受其他外在和内在因素的影响。根据当前的操作条件和往复式MBR的微生物群落组成，可以通过一些操作调整来进一步提高系统的脱氮和除磷效率。通过提高内部循环率和缺氧槽内的HRT/SRT来提高脱氮效果，这将有助于系统中已经丰富的反硝化菌(如脱氯单胞菌、假单胞菌)完成将硝酸盐还原为氮气的工作。同时，在当前的治疗过程中，通过增加厌氧区室可以丰富造成磷酸盐积累的低生物量（即，白色念珠菌）。然而，由于最初的种子污泥来自于一个不富集这些生物体的系统，从EBPR系统中添加PAOs相对丰度较高的接种物将是另一种选择。在MLE-MBR操作中，应通过允许有利于其生长的缺氧条件来维持氮螺属的高相对丰度.
4 与营养素去除有关的功能基因的量化
来自微生物群落分析的数据可能无法清楚地描绘出营养去除群落在去除往复式MBR的每个池中的N和P中的作用。为了进一步研究，我们对与完全氨氧化(amoA Nitrospira)、反硝化(nirS)和聚磷生物(16S Accumulibacter)相关的去营养基因进行了绝对定量。由于典型倍变细菌AOB的相对丰度明显较低，我们使用了氮螺旋菌(comammox)氨单加氧酶的功能基因编码进行comammox定量。然而，当与亚硝基螺菌作图时，典型AOB的amoA基因拷贝数表明，amoA -AOB的丰度显著高于amoA-Nitrospira的丰度（p<0.05），amoA -AOB平均丰度为每克污泥6.3×106（数据未显示），相比之下，amoA-Nitrospira的丰度仅为 3.7x104/g污泥。为了更好地理解这类生物的生态重要性，特别是在缺氧系统中，有必要设计一个引物来检测环境样品中各种形态的comammox，并更好地分离出新的Nitrospira。各容器中功能基因的箱线图(图2)显示，在研究期间，所有三个基因的对数值都类似，分别为4 (amoA-Ntsp)、7 (PAO)和10 (nirS)。单因素方差分析（ANOVA）显示，缺氧、好氧和MBR池中每克污泥的基因拷贝数无显著差异（p>0.05）。本研究未使用活性污泥样本的RNA来量化每个基因的表达。在往复式MBR系统中，硝化菌的存在与该生物体对低溶解氧的亲和力以及其在缺氧条件下生长的偏好有关。
图2。在生物养分去除系统中，每克污泥中涉及氮和磷去除的三个基因的基因拷贝数。氨氧化以Nitrospira的amoA基因为代表，该基因用于将氨完全氧化为硝酸盐。反硝化作用是以聚磷微生物Accumulibacter的16S rRNA基因为基础，编码硝酸还原酶（硝酸还原酶）基因的nirS基因。
5 往复MBR系统功能剖面分析
在操作的第一天（第0天）、第三个月（第79天）和实验室规模操作开始后的一年内，对从往复MBR池中提取的基因组DNA样本的鸟枪式测序结果进行分析。在往复式MBR系统中，氮和磷的去除包括酶驱动的过程和MBR池中同时发生的其他细胞活动，而同化的氮用于氨基酸合成，最终将成为细胞代谢的一部分。此外，使用葡萄糖作为系统的主要碳源，使得不同的碳水化合物代谢途径（如糖酵解、TCA等）成为MBR运行期间罐内原核生物代谢中最活跃的成分之一。图4总结了功能最强的直系同源物，最丰富的酶以及参与脱氮除磷的酶的百分比。在研究开始的第三天，第三个月和之后的一个月中，五个最丰富的功能直向同源物的量，即酶，转运蛋白，嘌呤代谢，DNA修复和重组蛋白以及氧化磷酸化的量没有显着变化。这表明这些途径对于生物体的新陈代谢，繁殖和生存至关重要。最丰富的酶是那些属于膜运输过程的酶，其总读数约为所标注酶总数的0.3％至0.6％。同时，参与脱氮除磷的酶分别占注解酶总数的0.4％和0.15％。尽管这些酶的百分比很小，但这些结果仍支持表明脱氮百分比高于磷的数据。不幸的是，参与完全氨氧化的酶在数据库中仍然没有与AOB的硝化基因区分开，因此不能在本研究中作为一个单独的组呈现。此外，约13％的宏基因组学读数仍未分配，一旦被鉴定，可能使我们对无曝气往复MBR在生活污水处理中的功能有更全面的了解。
图4 使用最丰富的KEGG功能标准(顶部)、酶(中心)以及在往复MBR槽中发现的氮和磷去除酶百分比，对往复MBR系统三个月后和一年连续流动操作的启动进行宏基因组学分析。在研究过程中，顶部功能原构和酶没有发现显著差异，这突出了它们在MBR生物过程中的重要性。
6 使用FISH观看养分去除群落的空间分布
往复式MBR产生的活性污泥絮凝物的3D共聚焦显微照片如图5所示。氨氧化细菌（品红色）分布在更大，更分散的簇中，而使用红色荧光染料标记并在与绿色叠加时显示橙色的亚硝酸盐氧化细菌普遍存在，并且在观察中似乎位于絮状物的局部。就邻近度而言，AOB的簇与NOB的簇之间的相互作用很小或没有。对117 µm x55 µm活性污泥絮凝物的定量分析显示，总共约有3000种细菌，其中3.8％是AOB（115计数），3.5％的反硝化/磷酸盐累积生物（105计数），而5.6％来自 NOB。这项研究使用的AOB代表是起源于β变形杆菌（例如Nitrosomonas），而选择了Nitrospira的探针来代表NOB。选择了Accumulibacter spp和Pseudomonas作为反硝化生物。这些结果与微生物群落数据一致，其中Nitrospira的相对丰度高于Nitrosomonas的相对丰度。在往复MBR的活性污泥中，氮螺旋菌的丰度高于典型氨氧化倍变形菌，这表明该体系中氨氧化的主要参与者可能是同源的氮螺旋菌。必须使用更丰富的物种或覆盖范围更广的目标来更好地可视化执行硝酸盐还原的生物及其在往复MBR中与硝化对应物的相互作用。
图5 (A)往复MBR中活性污泥的FISH显微照片，显示各种营养物去除群落，如氨氧化细菌(洋红色)、亚硝酸盐氧化细菌(橙色)、聚磷生物/反硝化生物(蓝色)和绿色荧光标记的普通细菌可以看出，AOBs (B)的数量低于NOB, NOB以Nitrospira属(C)为代表，而反硝化和聚磷生物(D)是种群中数量最少的。氨氧化细菌与硝化过程中将亚硝酸盐转化为硝酸盐的NOBs (5E)相互作用极小，甚至不相互作用。
结论
我们研究了微生物群落组成、营养物去除性能、功能概况，以及营养物去除群落在一种替代营养物去除结构中的分布。该营养物去除结构利用膜往复控制生物膜，并在低溶解氧浓度下运行。经过一年的运营，得出以下结论和启示：
使用针对营养物去除基团的荧光标记引物进行空间分布，使我们对负责往复MBR的营养物去除的生物体之间的相互作用有了更好的了解，并揭示了氨氧化螺菌在氨氧化中的重要性。
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