编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
肝脏-微生物组轴的重要性已越来越多地被认为是自身免疫的主要调节剂。这项研究利用一批初次使用糖皮质激素治疗的自身免疫性肝炎（AIH）患者与健康对照的肠道微生物进行了对比研究。研究通过16S rRNA基因测序对AIH（n = 91）和匹配的健康对照（n = 98）进行了研究，分析了28名患者和34名对照以验证结果。所有患者均在糖皮质激素治疗前被募集。
结果显示与健康对照组相比：
① 初治类固醇患者的肠道微生物组具有较低的α多样性（p<0.01）和独特的总体微生物组成。
②专性厌氧菌的耗竭以及包括韦荣球菌在内的潜在病原菌的扩展与疾病状况有关。重要的是，韦荣球菌是与疾病相关性最强的分类单元（p=8.85E-8），与血清天冬氨酸转氨酶水平和肝脏炎症呈正相关。
③此外，在研究队列中，4个与AIH相关的属可将AIH与对照组区分开，其AUC约为0.8。
④此外，在AIH肠道微生物组中，多个预测的功能模块也发生了变化，包括脂多糖的生物合成以及氨基酸的代谢，这些氨基酸可以被细菌加工产生免疫调节代谢产物。
本研究建立了AIH中肠道微生物组的组成和功能改变，并提出了使用肠道微生物群作为非侵入性生物标记物评估疾病活动的潜力。
原名：Alterations of gut microbiome in autoimmune hepatitis
期刊：Gut
IF：17.943
发表时间：2019.5.25
通讯作者：马雄＆唐茹琦
本研究采集了上海交通大学医学院门诊的AIH患者以及相应的健康者的粪便样品，3h后置于-80℃保存样品。对AIH患者进行肝活检，并根据scheuer系统评估炎症和纤维化的严重程度。对样品提取基因组后，通过16S rRNA基因测序对AIH（n = 91）和匹配的健康对照（n = 98）进行了横断面研究，分析了28名患者和34名对照的独立组以验证结果。所有患者均在糖皮质激素治疗前收集。
1 类固醇治疗的先天性AIH
科研人员研究了粪便微生物群，包括119名新诊断的AIH受试者以及132位年龄、性别和BMI匹配的健康对照者。根据受试者的注册顺序，将整个队列分为发现小组（AIH：91；对照组：98）和验证小组（AIH：28；对照组：34）。在发现队列中，AIH与个体内多样性的降低密切相关，通过香农多样性指数和观察到的OTU数量得以衡量（图1A）。校正年龄、性别和BMI后，结果得到证实。排除服用抗生素的患者后，相对于健康对照，AIH肠道微生物组的多样性仍然明显较低。在未使用UDCA治疗的患者中也观察到了这种趋势，但仅观察到的OTU数量达到了统计显着性（图1）。为了评估微生物组成的总体多样性，研究人员基于未加权的UniFrac距离进行了主坐标分析。变异的多变量多元分析表明，AIH和健康对照之间的肠道分类学组成存在显着差异（图1B）。两组之间的微生物群落在加权UniFrac距离和Bray-Curtis不相似性上也存在显着差异。
图1 类固醇治疗初治AIH患者(n=91)与健康对照组(n=98) alpha和beta多样性的比较
3 与对照组相比AIH中细菌丰富不同
为了鉴定差异丰富的分类单元，本研究对91名AIH类固醇个体和98名健康对照组的粪便微生物群组成进行了LEfSe分析。在AIH和健康对照中，拟杆菌和硬毛虫是最主要的门。但是，两组在门水平上均未观察到显着变化（图2A）。在属水平上，观察到AIH和对照之间存在显着差异（图3）。两组之间有15个细菌类群显示出明显的相对丰度。在调整了年龄、性别和BMI等协变量后，这些属中的11个仍显着不同（图2B）。在AIH中观察到细菌（包括梭菌，RF39，瘤胃菌科，理严菌科，颤螺菌，副细菌和共球菌）的丰度降低，而韦荣球菌，克雷伯菌，链球菌和乳杆菌的丰度增加。先前与PBC和原发性硬化性胆管炎（PSC）相关的韦荣球菌属与疾病状况之间具有最强的相关性（图2C）。为了进一步验证结果，进行了多元分析，以控制年龄，性别，BMI，抗生素使用和UDCA治疗的可能影响。最终确认了11个属中的7个，显示AIH与对照之间存在差异（p <0.05）。同样，韦荣球菌属是与疾病状况最显着相关的属（p = 0.0014）。
图2 AIH中粪便菌群组成的变化
4 基于肠道菌群的特征识别疾病状态
本研究使用肠道菌群作为生物标记物的潜在价值，发现包括韦荣球菌，乳酸杆菌，颤螺菌和梭菌四个属的组合可以将AIH与AUC（95％CI 0.71至0.84）的对照区分开（图3A和C）。但是，使用所有11个属并不能显着改善预测性能。使用MaAsLin确认的七个属，得出的AUC为0.74。然后，在28位未使用过类固醇的AIH和34位对照的独立队列中验证了模型的分类能力。仅韦荣球菌属产生的AUC为0.69（95％CI为0.55至0.83），以将AIH与对照区分开。使用上述四个属将AUC增加到0.81（95％CI从0.70到0.92），类似于从所有11个与AIH相关的属（AUC：0.78，95％CI 0.67到0.90）衍生的模型的性能作为由MaAsLin验证的七个属（AUC：0.81，95％CI 0.70至0.92）组成的模型（图3B）。因此，韦荣球菌，乳酸杆菌，颤螺菌和梭状芽孢杆菌的组合对AIH患者具有潜在的高诊断价值。
图3 基于肠道微生物群特征的疾病分类
5 肠道微生物与AIH疾病活动之间的相关性
采用Spearman部分基于等级的相关检验，考虑年龄、性别、BMI、抗生素和UDCA的使用，以研究所有未接受类固醇的AIH的临床变量与疾病相关属之间的相关性（图4A）。仅发现韦荣球菌属的丰度与天冬氨酸转氨酶（AST）呈正相关（rho = 0.216，p = 0.022）。随后进一步检查了韦荣球菌属，发现该物种与AST表现出更明显的相关性（rho = 0.266，p = 0.005）。然后根据中性弧菌的中位水平将AIH样品二分为二：高水平弧菌（n = 60）的AIH患者的血清AST水平比低水平弧菌的患者AST的水平增加约两倍（图4B）。在AIH患者中，肝脏组织学在确定诊断和评估疾病严重性方面起着关键作用。在本研究中，可获得90例AIH患者的肝脏组织学数据，进而能够探索肠道菌群与AIH的组织病理学程度之间的关系。27例患者有轻度/中度（0–2级）炎症，63例是严重（3–4级）炎症。轻度/中度（0-2期）纤维化36例，重度（3-4岁）纤维化54例。结果显示，患者的α-多样性或β-多样性与炎症等级或纤维化分期没有显着相关性（图4和5）。此外，轻度/中度炎症等级的患者与重度炎症等级的患者之间只有维永氏菌的丰度显著不同（p = 0.044，图4C）。在晚期炎症病例中，Dispar病毒含量更高（p = 0.013，图4C），突出了其作为无创生物标志物补充肝活检的潜力。然而，这些发现不能承受控制协变量的线性回归分析。
图4 肠道微生物群与AIH疾病活动的关系
6 AIH中的微生物功能性失调
为了研究AIH和对照之间微生物群落的功能和代谢变化，基于16S rRNA数据推断宏基因组，并使用PICRUSt分析了肠道菌群的功能潜力。LEfSe分析确定了32种KEGG类别，所有未使用类固醇的AIH（n = 119）和对照（n = 132）之间的丰度差异显著（p<0.05）。用MaAsLin控制混杂因素后，仍然有17个功能模块与疾病状态显着相关（p <0.05，图5）。研究人员还发现脂多糖（LPS）诱导促炎性细胞因子的生物合成相对于对照组在AIH微生物组中似乎过度表达，这可能与AIH中观察到的较高的TNF-α和IL6血清水平有关。此外，与多种氨基酸代谢有关的功能模块已发生变化。在AIH微生物组中，包括细菌趋化性在内的细胞运动性显著降低。
图5 预测宏基因组的功能分析
越来越多的证据表明，肠道微生物组的改变与几乎所有已知的肝病或免疫系统疾病有关。本研究中，通过16S rRNA基因描述了一个大型且新近诊断出的AIH人群的粪便微生物组的群落结构。数据结果表明，AIH微生物菌群失调的特征是细菌多样性较低，并且11个细菌属中的相对丰度发生了变化。基于微生物的特征，建立了具有区分疾病状态的能力的模型。最显著的发现是在AIH患者中高度富集的韦荣球菌属与疾病活动有关。与健康对照组相比，AIH患者的粪便微生物组表现出降低的物种丰富度和均匀度。低细菌多样性在各种疾病中屡有报道，被认为是肠道营养不良的主要类型之一。在先前的研究中，PBC和对照之间的样品内多样性差异不大，物种丰富度差异较小，PBC的均匀度降低。AIH的肠道功能障碍是由韦荣球菌，链球菌，克雷伯菌和乳酸菌的相对丰度增加以及7种细菌的丰度降低所定义的。在AIH中扩展的属也被证明富含PBC和PSC中的粪便微生物群。在本研究中，韦荣球菌属显示出与AIH最显着的关联。韦荣球菌与高水平的AST和晚期肝炎相关。先前的研究表明韦荣球菌产生了LPS，这与本研究的发现一致：LPS的生物合成在AIH的肠道微生物组中更加丰富。先前的研究分析了AIH患者的口腔微生物群，还发现AIH中韦荣球菌的相对丰度增加，这与唾液中IL-1β、IL-8的含量呈正相关。据报道也与几种严重的炎症有关，包括反复发作的克罗恩病、骨髓炎和心内膜炎。除相关证据外，鼠模型还显示出肠道微生物在促进肠道内外的炎症或扰动免疫稳态的过程中起着重要作用。AIH粪便中专性厌氧菌的减少和兼性厌氧菌（包括链球菌，克雷伯菌和乳杆菌）的扩增，表明微生物群落向更具耐氧性的微生物转移。许多厌氧性肠道菌群，例如瘤胃球菌科，协球菌和链球菌中的菌种，通过膳食纤维的发酵产生短链脂肪酸（SCFA）。SCFA通过消炎作用对健康产生有益作用。微生物群减少SCFA的产生会增加小鼠的腔内氧气浓度，从而导致兼性厌氧菌的扩增。用兼性厌氧菌替代厌氧菌可能是不同疾病条件下的常见表现，包括慢性肝病。组织学是准确诊断AIH所必需的，并且在疾病管理中也很重要。因此，迫切需要发现用于评估AIH中的肝脏炎症和纤维化的非侵入性生物标记。在本研究中，由韦永氏菌、乳杆菌、链球菌和梭菌组成的模型能够准确区分AIH和健康对照，随后进行验证。研究显示，随着疾病从轻度炎症发展到严重炎症。这些结果为无创性粪便测试有助于诊断和分层AIH个体的潜力提供了暗示性证据。除了明显增加的“LPS生物合成”途径外，推断的AIH的基因组还以参与氨基酸生物合成和代谢的模块功能障碍为特征。例如，在AIH的微生物组中色氨酸代谢发生了变化，色氨酸被肠细菌降解为几种吲哚衍生物。吲哚是芳烃受体（AhR）的配体，它通过分泌IL22来促进上皮屏障功能。此外，AIH微生物组中的精氨酸代谢耗竭，这可能导致其水平降低作为免疫调节代谢产物，多胺在肠粘膜和驻留免疫细胞的发育和维持中也起着重要作用。先前的研究表明AIH与肠道通透性异常和肠道微生物组功能异常有关。这项研究在24个AIH和8个健康对照中比较了双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌和肠球菌的16s rDNA基因，发现AIH中双歧杆菌和乳杆菌的表达不足。本研究结果存在差异，因为本研究中使用了更大的队列，包括未接受类固醇治疗的患者。最近的一项研究表明，在遗传易感的鼠模型和包括AIH在内的自身免疫性患者中，鸡肠球菌可以转运到肝脏并触发自身免疫应答。在本研究中，粪便样本中鸡大肠杆菌的相对丰度非常低，并且AIH和对照之间没有显著差异。本研究的主要优势包括在类固醇治疗开始之前收集样品，使用大量研究对象以及活检证实的AIH的详细表型分析。①首先，利用16S rRNA基因测序而不是宏基因组测序是该研究的一个缺点，它限制了物种水平和功能分析方面的数据解释。②其次，本研究的发现可能受到诸如药物、饮食摄入和环境因素等混杂因素的影响。尽管在分析中对抗生素和UDCA的使用进行了调整，但药物的混杂效应可能尚未得到彻底评估，只是简单地将抗生素或UDCA暴露的协变量视为二分法，而不考虑剂量效应，这可能会扭曲它们对肠道微生物组成的影响。此外，在本研究中未考虑其他药物，例如质子泵抑制剂。③第三，这是一项单中心研究，可能会限制基于微生物群的诊断模型的应用。本研究提供了关联而不是因果关系的证据，有必要进行进一步的研究来评估与疾病相关的细菌，是否以及如何在AIH发病机理中的免疫功能障碍和肝脏炎症中发挥作用。
本研究报告了对来自一个大型新诊断出的AIH人群的肠道微生物组的全面调查，并为疾病发病机理提供了新颖的见解，也增加了在AIH分层中使用非侵入性生物标志物的可能性。
肝脏-微生物组轴的重要性已被越来越多地认为是自身免疫的主要调节剂。本研究通过16S rRNA基因测序对AIH（n = 91）和匹配的健康对照（n = 98）进行了研究。结果显示：①初治类固醇的肠道微生物组具有较低的α多样性（p<0.01）和独特的总体微生物组成。②专性厌氧菌的耗竭和包括韦荣球菌在内的潜在病原菌的扩展与疾病状况有关。③此外，在AIH肠道微生物组中，多个预测的功能模块也发生了变化，包括脂多糖的生物合成以及氨基酸的代谢，这些氨基酸可以被细菌加工产生免疫调节代谢产物。本研究建立了AIH中肠道微生物组的组成和功能改变，并提出了使用肠道微生物群作为非侵入性生物标记物评估疾病活动的潜力。
自身免疫性肝炎（AIH）是一种慢性的，免疫介导的肝病，其特征是肝细胞破坏，循环中自身抗体的存在和IgG血清水平的升高。本文分析了一个大型且特征明确的新诊断AIH人群中肠道微生物组的情况，在类固醇治疗之前收集了样本，包括有肝活检的个体，因此含有组织学数据。本研究的发现有助于确定AIH的肠道营养不良以及与疾病严重程度的关系。
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