科研 | Food Chem.：茶叶经曲霉发酵过程中蛋白质组学和代谢组学的综合分析（国人佳作）

编译：草重木雪，编辑：Tracy、江舜尧。

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导读

后发酵普洱茶（PFPT）是一种具有独特感官特性和多种保健功效的微生物发酵茶。曲霉是PFPT发酵的优势真菌，也是PFPT发酵特性的主要贡献者，其潜在的功能值得深入研究。我们分别用蛋白质组学和代谢组学方法分析了茶叶在Aspergillus niger、Aspergillus tamarii和Aspergillus fumigatus发酵所得样品(命名为Asn、Ast和Asf)。我们观察到曲霉发酵产生的类黄酮，甘油磷脂，有机氧化合物和脂肪酸的组成发生了变化。我们鉴定了用于降解纤维素，淀粉，木质素，果胶，木聚糖和木葡聚糖的碳水化合物活性酶，例如内切葡聚糖酶和纤维素酶，还鉴定了糖苷水解酶、糖基转移酶、单宁酶、漆酶、香草醇氧化酶和苯醌还原酶，并推测它们可以催化酚类化合物的水解、氧化、聚合和降解。总结来看，曲霉可以产生改变茶叶中代谢产物浓度和组成的酶。

论文ID

原名：Integrated proteomics and metabolomics analysis of tea leaves fermented by Aspergillus niger, Aspergillus tamariiand Aspergillus fumigatus译名：茶叶经Aspergillusniger、Aspergillus tamarii和Aspergillus fumigatus发酵过程中蛋白质组学和代谢组学的综合分析（普洱茶研究）

期刊：Food Chemistry

IF：6.306发表时间：2020.07通讯作者：赵明；潘映红

通讯作者单位：云南农业大学；中国农科院

实验设计

实验结果

1. 代谢组学结果

在原理成分分析（PCA）得分图中，质量控制（QC）样品被聚类在一起，这表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。真菌发酵样品（Asn，Ast和Asf）与未接种的发酵样品（CK）的差异聚类，表明真菌发酵改变了茶叶中的代谢产物。Asf和Ast重叠，并与Asn分离，表明Asf和Ast中检测到的代谢产物密切相关，但与Asn中的代谢产物可区分（图1A）。与Asn-CK，Ast-CK和Asf-CK相比，55、116和107种代谢物的相对峰面积（PA）显着降低（VIP> 1.0，p <0.05和FC <0.66），包括1，42和30种代谢物的相对PA下降超过10倍。90、89和106个代谢产物的相对PA显着增加（VIP> 1.0，p <0.05和FC> 1.5），其中64、61和71个代谢产物的PAs增加>10倍（图1B）。我们总共鉴定出281种差异代谢物（DCM），例如没食子酸，槲皮素和3-葡萄糖没食子酸，这些DCMs分为脂质和脂质类分子（108种代谢物），苯丙烷和聚酮化合物（76种代谢物），苯类化合物（22种代谢物），有机氧化合物（22种代谢物），有机酸和衍生物（21种代谢物）和其他。DCMs进一步分为类黄酮（67种代谢物），甘油磷脂（41种代谢物），有机氧化合物（21种代谢物），脂肪酸（20种代谢物），羧酸和衍生物（19种代谢物），苯和取代的衍生物（16种代谢产物），异戊二烯醇脂质（15种代谢物），甘油脂（14种代谢物）等（图1C）。因此，非靶向的代谢组学分析可检测曲霉发酵后的类黄酮，甘油磷脂，有机氧化合物，脂肪酰基等的活跃代谢，这与普洱茶的工业发酵一致，然后应用蛋白质组学分析来识别导致这些代谢变化的酶。

图1 代谢组学分析结果

（A）在质量控制样品（QC），对照未发酵茶（CK）和经A. niger（Asn），A. tamarii（Ast）和A. fumigatus (Asf)发酵的茶叶中检测到的峰面积的主成分分析（PCA）。（B）比较Asn-CK，Ast-CK和Asf CK之间差异变化的代谢物（DCM）相对峰面积的倍数变化（FC）分布。（C）DCM的分类。

2.  蛋白质组学

493到1632个蛋白质的重复分析(ProteomeXchange Consortium PXD015798)，在Asn、Asf和Ast中分别鉴定出2035、2210和1095个独特蛋白，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Q12552)、1,3-β-葡萄糖苷转移酶(G3Y0U4)，甘肽n-十四酰基转移酶(G3Y8R4)。除未分类的组外，高度代表的GO类包括催化活性和分子功能结合，生物过程中的细胞过程和代谢过程，以及细胞组分的细胞部分和细胞成分。69条KEGG通路显著富集(p < 0.05)，富集程度最高的为“代谢通路”(ko01100)和“次生代谢产物生物合成”(ko01110)。排除了全局通路，这些富集的KEGG通路分为三类:细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理和代谢。富含“新陈代谢”的KEGG途径进一步分为“氨基酸代谢”，“碳水化合物代谢”，“脂质代谢”，“辅因子和维生素代谢”，“其他氨基酸代谢”，“能量代谢”，“聚糖的生物合成和代谢”，“核苷酸代谢”以及“萜类和聚酮化合物的代谢”。属于“脂质代谢”的六个大量富集的KEGG途径，包括α-亚麻酸代谢（ko00592），甘油磷脂代谢（ko00564），甘油脂代谢（ko00561），酮体的合成和降解（ko00072），脂肪酸降解（ko00071）和脂肪酸生物合成（ko00061），可以解释“脂质和类脂质分子”中代谢产物的动态变化，其中包括甘油磷脂(41种代谢物)、脂肪酸(20种代谢物)、丙烯醇类脂类(15种代谢物)、甘油脂类(14种代谢物)、甾醇类脂类(8种代谢物)、类固醇及其衍生物(6种代谢物)和鞘脂类(4种代谢物)。KEGG途径的其他富集属于“氨基酸代谢”和“氨基酸的代谢”，可能会导致氨基酸，肽和类似物的水平变化（17种代谢物）。总的来说，大多数被鉴定的蛋白质属于细胞过程或代谢过程，并在属于代谢的途径中富集，这支持真菌的生长和繁殖，也导致发酵茶叶中主要代谢产物的水平变化，如氨基酸和脂类。总的来说，大多数被鉴定的蛋白质属于细胞过程或代谢过程，并在属于代谢的途径中富集，这支持真菌的生长和繁殖，也导致发酵茶叶中主要代谢产物的水平变化，如氨基酸和脂类。

3.  碳水化合物:茶叶中碳水化合物的活性酶和代谢

CAZymes是指涉及糖或糖衍生物生物转化的大量催化活性，这些催化活性将单糖组装成寡糖或多糖，以及与核酸，蛋白质，脂质，多酚和其他化合物结合。它们负责碳水化合物的合成（通过糖基转移酶[GTs]），降解（糖苷水解酶[GHs]，多糖裂解酶[PLs]，碳水化合物酯酶[CEs]，辅助活性酶[AAs]）和碳水化合物识别（碳水化合物结合模块[CBM]）。曲霉基因组具有广泛的CAZymes，例如黑曲霉CBS513.88包含176个预计编码CAZymes的基因。在这项研究中，Asn，Asf和Ast蛋白质组中的232、205和226酶分别标注到CAZy数据库中的103、86和97项中，包括所有六个家族：GH，GT，AA，CE，PL和CBM。家族成员最多的是GH3（24个蛋白），GH28（20个蛋白），GH18（14个蛋白），GH31（13个蛋白），GH16（11个蛋白），GH7（11个蛋白），GH2（11个蛋白）（图2A），AA7（21个蛋白质），AA3_2（11个蛋白质），AA3_3（9个蛋白质）（图2B），CE10（30个蛋白质），CE8（10个蛋白质），PL1_4（18个蛋白质（图2C），GT4（17个蛋白）和CMB1（11个蛋白）。通过代谢组学分析，我们鉴定出50种糖苷，其中大部分为糖苷（22种代谢物），葡糖醛酸苷（7种代谢物）和吡喃葡萄糖苷（5种代谢物）。与CK相比，Asn，Ast和Asf中9个，26个和22个糖苷的相对水平降低（VIP> 1.0，p <0.05和FC <0.66），而13，19和15个糖苷的相对水平增加（VIP>1.0，p<0.05和FC>1.5）。由于GH（EC 3.2.1-）和GT（EC 2.4.x.y）分别催化糖苷键的水解和形成，因此它们的水平似乎因其对发酵茶叶中糖苷的作用而改变，例如，34个葡糖苷酶和一种UDP-葡糖基转移酶被鉴定，它们可能参与了糖苷和吡喃葡萄糖苷的代谢；α-葡萄糖醛酸苷酶，β-葡萄糖醛酸苷酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶可能会水解葡萄糖醛酸苷；α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，龙胆二糖酶和鼠李糖苷酶可能分别水解半乳糖吡喃糖苷，半乳糖苷，龙胆苷和鼠李糖苷。

根据先前对曲霉中CAZymes的分析，在本研究中我们鉴定了属于35个CAZymes家族或亚家族的119种蛋白质，并假设它们可降解植物多糖，包括纤维素，淀粉，木质素，果胶，木聚糖和木葡聚糖。内切葡聚糖酶，α/β-葡萄糖苷酶和纤维素酶可能参与纤维素的降解。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶降解淀粉。过氧化物酶属于AA2和裂解多糖单加氧酶（LPMO）家族，葡萄糖-甲醇胆碱氧化还原酶，葡萄糖氧化酶，醇氧化酶和半乳糖氧化酶参与木质素的降解。果胶裂解酶，果胶裂解酶，鼠李糖半乳糖醛酸裂解酶，聚半乳糖醛酸酶，内聚半乳糖醛酸酶，α-L-鼠李糖苷酶和果胶酯酶作用于果胶骨架，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和内-β-1,4-半乳糖苷酶可能作用于果胶的毛状区域的侧链；Endo-1,4-β-木聚糖酶，木糖苷酶和半乳糖苷酶能够降解木聚糖和木葡聚糖；植物多糖的降解会溶解茶叶细胞壁并导致茶叶软化。我们观察到PFPT发酵过程中茶叶软化的现象以及以前的报告支持了这一点，该研究表明茶叶的表面被微生物覆盖，并且它们的细胞结构很大程度上在发酵后破坏。在最近的一份报告中，我们还确定了可能参与普洱茶工业发酵中茶糖代谢的CAZymes，因此，曲霉菌在普洱茶发酵中的作用似乎是产生CAZymes，其参与糖苷和多糖的代谢以及寡糖的产生，然后负责普洱茶的醇香口味。

图2 碳水化合物活性酶的注释

（A）糖苷水解酶[GHs]。（二）辅助活动[AAs]。（C）碳水化合物酯酶[CEs]和多糖裂解酶[PLs]。（D）糖基转移酶[GTs]和碳水化合物结合模块[CBM]。圆直径表示分配给每个家族的酶的数量。蓝，绿，蓝和红线分别表示在由黑曲霉（Asn），塔氏曲霉（Ast）和烟曲霉（Asf）发酵的样品中鉴定的酶。

4.  茶酚类化合物代谢中涉及的酶

多酚（主要是儿茶素）是茶的特征，已显示出许多健康益处，例如减少冠心病，糖尿病和癌症的发生率，此外，儿茶素的氧化在发酵过程中产生聚合物产品对于茶的感官质量至关重要。在这项研究中，我们鉴定出77种多酚和22种苯甲酸盐，它们可以归类为酚类化合物，包括（±）儿茶素，没食子酸和槲皮素。这些化合物可进一步分为酚类糖苷（38代谢产物），酚酸酯，包括11种没食子酸酯和1种咖啡酸酯，酚酸（12种代谢物）等。与CK相比，Asn，Ast和Asf中18、53和48种酚类化合物的相对含量分别显著降低（VIP> 1.0，p <0.05和FC <0.66）。此外，它们中的29、40和36有所增加（VIP>1.0，p<0.05和FC>1.5）。如上所述，酚类糖苷被GH降解，例如，葡糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，半乳糖苷酶和鼠李糖苷酶。此外，曲霉发酵后，一种或多种样品（如飞燕草素3-咖啡酰葡糖苷）中的8种黄酮-3-O-糖苷，4种黄酮-7-O-糖苷和一种黄酮8-C-糖苷的相对水平增加。GT1家族中注释了7种酶（B8NGA8，Q5AZU6，A0A1F7ZJI4，A0A1M3TYR2，A0A3F3RCY7，A0A0U5C128和A0A1L9WXZ2），并显示出与UDP-葡萄糖醛糖基转移酶或UDP-葡萄糖基转移酶的同源性。根据CAZy数据库的注释，GT1包括黄酮醇3-O-葡糖基转移酶（EC 2.4.1.91），花青素3 O-葡萄糖基转移酶（EC 2.4.1.115），花青素3-O半乳糖基转移酶（EC 2.4.1.-）和黄酮-8-C-糖基转移酶，因此，我们推测GT1家族的这些酶参与了类黄酮糖苷的合成，从而导致其水平升高。

我们鉴定出11种没食子酸酯，例如（-）-儿茶素没食子酸酯，儿茶素3-O-gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯和3-葡萄糖没食子酸并显示水平下降，而2-肉桂酰基-1,6-二对戊二酰基β-D-吡喃葡萄糖的含量增加了。CEs是催化取代糖的O-或N-去酰化的酶；单宁酶（E.C：3.1.1.20）是一种CE，可催化水解单宁酸（如单宁酸）中酯键的分解，从而产生没食子酸和葡萄糖。通过dbCAN注释，我们鉴定出57个CE，并将其分配给CE1，CE4，CE5，CE8，CE10，CE12和CE16家族，其中最多的是CE10（30种蛋白质）和CE8（10种蛋白质）（图2C）。另外，通过UniProt注解鉴定出28种羧酸酯酶。我们手动检查UniProt中的注释，鉴定出单宁酸酶，包括Asn、Ast和Asf中六个（A0A100IAT1，A0A146F2H6，A0A1L9N5Y7，A0A1M3T559，A0A1R3RGG8和G3YCQ1），四个（A0A0L1J7V2，A0A1L9N5Y7，A0A1S9DXC9，Q000I5），3个（A0A1L9N5Y7, A0A1S9DKA2，Q000I5）。其中鞣酸酶可以水解没食子酸酯并释放出酚酸，这可以解释这些化合物的不同浓度。没食子酸酯的水解是减少普洱茶涩味的原因。

AAs是与CAZymes结合起作用的氧化还原酶。在本研究中，我们将Asn，Asf和Ast中的26、26和34个酶分别注释为AAs的7个，8个和10个亚家族（图2B）。根据CAZy数据库中的注释，AA1酶是多铜氧化酶，使用双酚和相关物质作为供体，氧作为受体。在这项研究中，我们将5种蛋白质分配给AA1（A0A117E1I5，A0A1M3T7I9，A0A1F7ZZD2，A0A1F7ZZD2和A0A1L9UZX1），它们与漆酶具有同源性（表1）。漆酶(苯二醇:氧氧化还原酶，EC 1.10.3.2)属于多酚氧化酶家族，催化多种酚类底物的聚合，如儿茶素、儿茶酚、没食子酸、阿魏酸、丁香醛、香草醛、乙酰香草醛、针叶醇和芦丁。AA4（香草醛醇氧化酶）催化芳香环对位上带有侧链的多种酚类化合物的转化。两种酶（A0A1L9N8M8和A0A1L9TBF2）被确定为属于AA4家族，与香草醛醇氧化酶相似。据报道，香草醛醇氧化酶可催化多种对位取代的酚类化合物的氧化，包括A0A1L9NCG6和A0A1F8A287在内的两种酶被分配到AA6家族，与苯醌还原酶相似（表1）。苯醌还原酶催化醌还原为对苯二酚，并参与芳香族化合物的生物降解和保护真菌细胞免受反应性醌类物质的侵害，因此，本研究中鉴定的漆酶，香草醛醇氧化酶和苯醌还原酶可能参与了多酚和苯类化合物的氧化，转化和生物降解，并导致多酚含量的减少和茶黄素的含量增加；多酚的减少导致涩味的减少和醇厚的味道的增加；茶黄素的增加是棕红色茶的注入和健康益处的原因；对于茶黄素，可通过调节肠道菌群和胆汁酸代谢来减轻高胆固醇血症。

图3 可能参与糖苷水解或合成的糖苷水解酶[GHs]和糖基转移酶[GTs]，其相对水平的变化显示为Asn-CK，Ast-CK和Asf-CK比较之间糖苷相对峰面积的倍数变化（FC）的热图

图4 降解植物多糖的酶

包括木质素，淀粉，纤维素，果胶，木聚糖和木葡聚糖

图5 参与茶酚类化合物代谢的酶

表1 可以代谢酚类化合物的酶

我们推测茶多酚和苯类化合物的代谢会导致其相对水平的变化，其催化作用如下：（1）通过GHs或GTs水解或合成酚糖苷；（2）将鞣酸酶水解酚酯，生成酚酸。（3）酚类化合物被漆酶和香草醇氧化酶氧化或聚合；（4）苯醌还原酶降解了酚类化合物中的芳环（图5）。因此，曲霉菌在普洱茶发酵中的另一个作用是产生GHs，GTs，鞣酸酶，漆酶，香草醇氧化酶和苯醌还原酶，它们催化酚类化合物的水解，氧化，转化和生物降解。以前的报告描述了普洱茶工业发酵中酚类化合物的代谢网络。目前对纯培养发酵样品的蛋白质组学分析，不仅验证了GH，GT和鞣酸酶的存在，而且还鉴定了漆酶，香草醛醇氧化酶和苯醌还原酶。Lee等报道了从普洱茶茶叶中分离出来的由曲霉产生的漆酶可以将EGCG氧化成游离儿茶素，酯儿茶素，没食子酸和茶色素。在最近的一份报告中，我们证实了黑曲霉生产鞣酸的过程及其在茶叶中没食子酸酯的水解作用。因此，以前的报告证实了GH，GT，鞣酸和漆酶的存在，以及漆酶的氧化作用和鞣酸的水解作用。其他酶的存在和催化作用需要进一步研究。

结论

A. niger，A. tamarii，A. fumigatus接种到茶叶中，实现纯培养发酵。真菌蛋白质和茶代谢产物的变化使用蛋白质组学和代谢组学综合分析进行了表征。我们鉴定了可以降解植物多糖的CAZymes，包括纤维素，淀粉，木质素，果胶，木聚糖和木葡聚糖，确定了可以催化酚类化合物水解，氧化，聚合，转化，生物合成和降解的酶。这种纯培养物的发酵分析表明，曲霉菌在PFPT发酵中的功能是（1）产生CAZymes来代谢糖苷和多糖，并有助于普洱茶的醇香口感。（2）产生GH，GT，鞣酸，漆酶，香草基醇氧化酶和苯醌还原酶来水解，氧化，转化和生物降解茶叶中的酚类化合物，降低多酚的含量并增加茶黄素的含量，这是导致涩味的减少和醇厚味道的增加，以及棕红色茶的注入以及普洱茶的健康益处的原因。这些发现促进了对曲霉的功能的认识，形成了独特的感官特征和有益健康的PFPT。原文链接：  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32711271/