科研 | 中国科学院：多平台代谢组学揭示了糖尿病性视网膜病变受试者的新型血清代谢物生物标记物
编译：牙牙更健康，编辑：Tracy、江舜尧。
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糖尿病性视网膜病（DR）作为糖尿病（DM）的主要微血管并发症，仍然是世界范围内工作的老年人视力丧失的主要原因，因此DR的筛查和早期诊断在预防和治疗中尤为重要。血红蛋白A1c（HbA1c）是DR病程中唯一经过验证的系统生物标志物，但HbA1c仅解释了6.6％的视网膜病变风险变异，因此，人们仍然迫切需要鉴定用于DR筛选或检测的新型生物标志物。代谢组学旨在提供一种在复杂生物基质中对低分子量代谢物进行综合分析的方法。许多研究已显示出明显的代谢紊乱与DM和DM相关并发症有关，目前DR的代谢组学研究仍处于早期阶段，而且考虑到玻璃体取样的侵入性，使用玻璃体生物标记物检测DR并不容易。由于患者具有复杂的遗传和微环境背景，发现新的生物标记物需要进行全面的代谢组学研究，核磁共振（NMR）光谱，液相色谱-质谱（LC-MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）是代谢或脂质组分析的最有用工具。多种平台的组合，包括GC-MS代谢组学（GCMSM），LC-MS代谢组学（LC-MSM）和LC-MSL，更适合于检测尽可能多的代谢物。本研究的目的是从多个分析平台获取代谢谱数据，以全面阐明与DR发生和发展相关的异常代谢，并进一步确定可靠的血清生物标志物，以诊断糖尿病人群的DR和早期DR。
论文ID
实验设计
实验结果
在本研究中，我们应用非靶向GC-MSM,LC-MSM和LC-MSL平台，全面阐述了DR、早期DR的代谢谱以及DR发展过程中的代谢紊乱途径。实验分为发现集和训练集，训练集共收集461个血清样本，包括111个NDR样本和350个DR样本，以探索DR的异常代谢和功能障碍的途径（与NDR相比），并建立了可靠的生物标记模型。在这些DR样本中，分别有99、90、85和76个病例被诊断为NPDR，中度NPDR（MNPDR），严重NPDR（SNPDR）和增生性DR（PDR）。在验证集中，共444个血清样本，其中105 NDR，103 NPDR，103 MNPDR，113 SNPDR和20 PDR样本被用于测试定义的生物标志物组，我们也评估了其对DR和早期DR的诊断性能。最后，我们研究了2-哌啶酮对人视网膜内皮细胞（hRECs）的影响，以探讨其是否与DR的发作和进展有关。
1. DR代谢和脂质分析
首先，发现集通过GC-MSM，LC-MSM和LC-MSL分析，NDR与DR组偏最小二乘法判别（PLS-DA）的得分图及置换检验验证模型可靠且无过拟合（R2= (0.0, 0.12), Q2=(0.0, −0.12);R2= (0.0, 0.12), Q2= (0.0, −0.13); R2= (0.0,0.06), Q2= (0.0, −0.06) ）（图1A，B,C）。DR受试者与NDR受试者组明显分离意味着DR中发生了异常代谢，随后我们针对DR和NDR组之间三个平台鉴定出的代谢物进行了单变量分析（非参数测试）。共有348种独特的代谢产物（分别来自GC-MSM，LC-MSM和LC-MSL的93、119和194种代谢产物）满足p <0.05和错误发现率（FDR）<0.05的标准（图1D）。另外，非参数测试也用于脂质，与NDR受试者相比，DR受试者中多种脂质（亚）类（例如，脂肪酸，磷脂和鞘脂）显着增加（图1E）。
图1 NDR和DR的偏最小二乘判别分析得分图
包括A）GC-MSM，B）LC-MSM和C）LC-MSL发现集中的NPDR，MNPDR，SNPDR和PDR组。D）当在基于GC-MSM，LC-MSM和LC-MSL的发现集中将DR组与NDR组进行比较时，显示出差异代谢物的维恩图。E）在发现集中基于LC-MSL的显着差异脂质（亚）类的血清相对浓度。F）基于LC-MS平台的发现和G）验证集中的12-HETE和2-哌啶酮的血清浓度。H）GC-MSM，I）LC-MSM和J）LC-MSL发现集中的NDR和NPDR组的PLS-DA得分图。K）当在基于GC-MSM，LC-MSM和LC-MSL的发现集中将NPDR组与NDR组进行比较时，显示出差异代谢物的维恩图。L）在发现集中基于LC-MSL的显着差异脂质（亚）类的相对血清浓度。M）基于LC-MS平台的发现和N）验证集中的12-HETE和2-哌啶酮的血清浓度。使用非参数检验在Wilcoxon，Mann-Whitney检验和基于Benjamini-Hochberg的FDR模式下比较了代谢物数据，与NDR相比* p <0.05和/或FDR <0.05。
2. 早期DR（NPDR）的代谢和脂质分析
根据GC-MSM（图1H），LC-MSM（图1I）和LC-MSL（图1J）的代谢组学数据，NPDR组也明显与NDR组分离。此外，来自GC-MSM，LC-MSM和LC-MSL平台的总共81、103和156种代谢产物在NPDR和NDR组之间存在显着差异（图1K），相对于NDR受试者，多种脂质（亚）类（例如，脂肪酸，磷脂和鞘脂）的总水平在NPDR受试者中显示出显着增加（图1L）。
3.不同临床等级DR的代谢和脂质谱分析
最后，在发现研究中，我们根据鉴定出的RSD小于30％的代谢物进行非参数测试，以鉴定NDR，NPDR，MNPDR，SNPDR和PDR两种临床级别之间的差异代谢物。与三个分析平台上的NDR组相比，PDR和非PDR（包括NPDR，MNPDR和SNPDR）组中的大量代谢物存在显著差异，与非PDR组相比，PDR组中一些代谢物显示出显著差异。但是，几乎没有代谢物在NPDR，MNPDR和SNPDR之间的成对比较中显示出显着变化。此外，我们还观察到PDR组趋向于更接近NDR组的趋势，这意味着PDR组与NDR组相比具有比其他组（例如NPDR，MNPDR和SNPDR）更相似的代谢分子特征。
4.差异途径分析
为了系统地评估DR发展背后的代谢紊乱，我们基于发现人群的代谢组学数据进行了途径分析。DR引起的代谢紊乱主要与糖酵解代谢，TCA代谢，尿素循环代谢，多元醇代谢，氨基酸代谢（例如，甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢；牛磺酸和次牛磺酸代谢；精氨酸-脯氨酸代谢；缬氨酸-亮氨酸）有关–异亮氨酸的生物合成）和脂质代谢（例如，磷脂代谢，鞘脂代谢，甘油酯代谢和脂肪酸代谢）有关。
5.发现集中DR的代谢物标记和诊断性能
在发现集中代谢产物发生显著变化的过程中，12-HETE和2-哌啶酮的水平在DR组显著高于NDR组（图1F）。我们基于12-HETE和2-哌啶酮对DR和NDR组进行了二进制逻辑回归分析，以确定明确的生物标物，其诊断性能（AUC 0.946）在区分DR和NDR（表1）方面的诊断性能优于12-HETE（AUC 0.924），2-哌啶酮（AUC 0.882）和HbA1c（AUC 0.691），还显示出比HbA1c（0.657和0.686）高的敏感性和特异性（0.894和0.919）。NPDR组中12-HETE和2-哌啶酮的水平高于NDR组（图1M），生物标志物组的诊断性能（AUC0.958）在区分NPDR和NDR方面优于12-HETE，2-哌啶酮和HbAc1。此外，生物标志物组在NDR中区分NPDR显示出比HbA1c（0.611和0.686）更高的敏感性和特异性（0.929和0.901）（表1），这些结果突出了这种代谢物生物标志物组的早期诊断潜力。
表1 用于诊断DR的不同代谢物标记物和HbA1c的结果
6. 验证集中DR的代谢物标记和诊断性能
为了验证生物标志物组在区分DR或早期DR与NDR方面的诊断性能，我们分析了验证集的444个样本（包括105 NDR，103 NPDR，103 MNPDR，113 SNPDR和20 PDR）（表2）。基于LC-MS平台，我们在多反应监测（MRM）模式中对12-HETE和2-哌啶酮进行了定量。在验证集中，DR和早期DR的血清12-HETE和2-哌啶酮的浓度要比NDR高得多（图1G，N）。通过对数回归和NPDR检测的逻辑回归模型，生物标志物组在区分NDR和DR和NPDR方面显示出比HBA1c更高的诊断性能。
表2 每组受试者的临床特征
7. 代谢异常和脂质途径
代谢组学提供了对疾病途径的独特见解，因为代谢产物是所有生物过程的产物，它们的差异水平反映了环境和遗传因素之间复杂的相互作用。我们的研究使用多种分析平台（GC-MSM，LC-MSM和LC-MSL）对个体与DR相关的血清代谢物谱变化进行了系统评估，以涵盖尽可能多的代谢物。在描述的348种独特代谢产物中，我们确定了与DR发病相关的代谢产物比其他研究多得多，涵盖了涉及TCA和尿素循环代谢，（支链）氨基酸，多元醇，核苷酸及其衍生物，肉碱，胆汁酸的代谢产物以及脂质等。此外，我们使用区分代谢物的完整代谢途径分析探索基于代谢途径的代谢组学特征，这些特征主要与能量代谢，氨基酸代谢和脂质代谢相关（图2）。
能量代谢在DR的发生和发展中起关键作用，糖酵解和TCA循环是两个主要的能量代谢途径。实验发现，与葡萄糖代谢相关的乳酸在DR患者中显示出显着增加（图2A）。此外，与NDR相比，DR中柠檬酸，异柠檬酸，琥珀酸，富马酸和苹果酸的水平也显着增加（图2A），反映了TCA系统增加的可能性。许多研究表明线粒体功能障碍与糖尿病及其并发症密切相关，实验观察到，相对于NDR，DR的TCA途径中右侧（富马酸和苹果酸）代谢物的倍数变化小于左侧（柠檬酸，异柠檬酸和琥珀酸）的倍数变化。我们假设右侧的中间体用于增强尿素循环，而左侧的中间体则通过天冬氨酸代谢得到补充。DR中天冬氨酸代谢的增加和尿素循环的增加似乎证实了上述假说，但详细的机制有待进一步研究。总体而言，能量代谢增加与DR的发展有关。
我们发现，DR中大多数氨基酸的水平比NDR显着提高（图2A）。丝氨酸和甘氨酸残基可以丰富感光蛋白视紫红质，而视紫红质与丙酮酸激酶M2的磷酸化密切相关，因此可以稳定Warburg效应。视紫红质的减少是糖尿病患者眼组织中相对维生素A缺乏的结果；DR中精氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸和脯氨酸的含量较高，反映了精氨酸代谢的上调。与许多其他研究一致，精氨酸代谢的增加可能是DR的介质，分支链氨基酸（BCAA）代谢中亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸的水平也增加了。循环中BCAA水平的升高被认为与视网膜中谷氨酸的强烈神经毒性有关，这在DR神经退行性变中起重要作用。BCAAs通过激活哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）途径发挥作用，其在调节细胞生长，增殖和存活以及上调VEGF途径中起作用，而VEGF途径的激活导致Caspase-3表达增加，从而导致视网膜损伤。因此，我们应更加关注氨基酸的水平，这将有助于理解DR的发病机制。
相对于NDR，DR中大多数脂质的水平显著增加。鞘脂作为脂质的必需成分之一，近年来由于其在信号转导，细胞增殖，迁移，凋亡和膜结构成分中的关键作用而受到越来越多的关注。神经酰胺，鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸（S1P）已被确定为具有生物活性的鞘脂，同时S1P影响血管的形成，分化和内皮细胞迁移。已有报道鞘脂谱的改变，例如神经酰胺和某些己糖神经酰胺的单个分子的转化，因此，由磷脂酰胆碱和鞘脂生物合成增加引起的高鞘脂水平（图2B）可能会加剧细胞增殖和血管形成，在DR发病和进展中起非常重要的作用。
图2 DR中代谢途径的改变
黑色文字表示检测到的代谢物没有明显变化，红色文字表示代谢物大量富集（例如，多种氨基酸），绿色文字表示将DR组与NDR组进行比较时代谢物的大量消耗（例如，磷脂酰丝氨酸，PS），灰色文字表示未检测到的代谢产物。使用Wilcoxon，Mann-Whitney检验和基于Benjamini-Hochberg的FDR模式的非参数检验比较了代谢物数据。
8. 鉴定和验证生物标志物
目前，鉴定用于检测DR的新型潜在血清生物标志物仍然是重要的目标，在利用单变量分析进行系统筛选之后，我们鉴定并验证了包括2-哌啶酮和12-HETE的生物标志物组。在这项研究中，我们还对NPDR患者的血清代谢物检测结果进行了早期诊断，该小组在从高危人群（NDR）分离出DR和早期DR（NPDR）方面显示出非常好的表现。在发现组和验证组中，我们对DR的诊断准确性范围分别为75.0–92.9％和80.6–95.0％。12-HETE是一种类二十烷酸，是人类中12脂氧合酶（LOX）的主要产物，可在hRECs中诱导内质网（ER）应激。许多研究表明，类花生酸代谢紊乱在疾病进展中起关键作用，实验发现循环的12-HETE水平在DR中逐渐增加，并与DR的发生和发展呈正相关。许多研究表明12-LOX通过激活ER应激，NADPH氧化酶和VEGFR2信号网络参与DR中的视网膜微血管失调，并且破坏Ca2 +动态平衡可能是促进信号通路的必要步骤。另一种生物标记物2-哌啶酮，是一种在工业上广泛用于合成聚合物（尼龙5）的单体，迄今为止尚未报道血清中2-哌啶酮的存在。在我们的研究中，DR和早期DR中循环使用的2-哌啶酮水平显着增加。一些研究报告说，2-哌啶酮水平的升高可能是由于饮食摄入和尸胺转化而引起的，尸胺是赖氨酸脱羧产生的普通精液和尿液代谢产物。据报道2-哌啶酮是CYP2E1活性的潜在代谢生物标志物，因为尸胺向2-哌啶酮的转化以及2-哌啶酮向6-羟基-2-哌啶酮的转化与CYP2E1正相关，但是，我们找不到通过细胞生物学研究确定的2-哌啶酮的相关途径或生物学功能，因此，我们研究了2-哌啶酮在hREC中的生物学功能，以确定2-哌啶酮是否具有与DR进展相关的生物学功能。
结论
综上所述，我们的上述数据突出了代谢组学研究对于确定DR发病机理的潜在重要性，并表明代谢组学谱分析可以从高风险的中国人群中有效识别DR和早期DR的诊断标志物。此外，我们的研究结果表明，一种新颖的生物标志物（2-哌啶酮）具有促进hREC增殖，血管生成和炎症的生物学功能。据我们所知，这是最全面的代谢组学研究，涉及大量人群，研究代谢谱与DR发作和进展之间的关系，这项基于多平台的代谢组学研究为使用少量血清筛选DR全面探索复杂的代谢网络提供了实用的策略，其结果可作为进一步临床检查的参考。