科研 | Chemosphere：体内外评估CdSe/ZnS量子点暴露毒性分子机制

编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。

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导读

近年来，人们在技术和生物医学行业中越来越多地使用不同类型的量子点。由于这些量子点的使用范围扩大，它们已成为潜在的新兴污染物，因此有必要评估它们的潜在毒性以及它们对健康和环境可能产生的影响。虽然这方面已有研究，但CdSe/ZnS量子点发挥毒性作用的分子机制尚不清楚。为此，本研究设计了一种全面的蛋白质组学方法，将硅酸盐策略应用于体外模型(肝细胞)和超硅酸盐替代体内模型，特别是斑马鱼幼体。这种整体方法与其他生物分析方法共同使鉴定蛋白质，分子机制以及因暴露于CdSe/ZnS量子点而改变的生物过程成为可能。研究表明，一方面，这些量子点可以诱导肝细胞缺氧和ROS的产生，并通过TDP-43通路导致细胞凋亡；另一方面，有研究表明，暴露在CdSe/ZnS量子点对发育中的生物体有很大的影响，导致严重的神经和发育问题的运动系统。

论文ID

原名：In-vitro and in-vivo evaluation of the molecular mechanisms involved in the toxicity associated to CdSe/ZnS quantum dots exposure

译名：体内外评估CdSe/ZnS量子点暴露毒性分子机制

期刊：Chemosphere

IF：5.778

发表时间：2021.01

通讯作者：J L Luque-Garcia

通讯作者单位：马德里孔普卢腾斯大学

实验设计

1. 采用MTT检测了不同浓度的量子点对细胞活力的影响；

2. 采用LA-ICP-MS检测量子点在斑马鱼幼体中的生物积累和生物分布，并利用量子点的荧光特性，我们通过荧光显微镜评估了它们在HepG2细胞中的细胞内化动力学；

3. 采用SILAC实验检测暴露于量子点后HepG2细胞中发生改变的蛋白；

4. 使用超SILAC实验检测暴露于量子点后斑马鱼幼体体内定量蛋白质组学。

实验结果

1. 量子点的细胞毒性

为了研究量子点的细胞毒性，我们采用MTT检测了不同浓度的量子点对细胞活力的影响。选择HepG2细胞作为体外模型是因为这些纳米颗粒已经被证明在小鼠、大鼠和非人类灵长类动物的肝脏中积累。正如预期的那样，暴露72小时后，随着量子点浓度的增加，观察到细胞活力下降，从1-200 mg/ L(图1)。可以看出，在50 mg/L后，活力显著下降，在较高的检测浓度(200 mg/L)时接近0%。在此基础上，为了进一步研究CdSe/ZnS量子点在不显著影响细胞活力的情况下的毒性，我们选择20 mg/L和72 h进行下一步实验。 

图1 HepG2细胞暴露于不同浓度(0.1-200 mg/L)的CdSe/ZnS 量子点 (n10)后，细胞存活率显著提高

2. 量子点的细胞摄取和定位

为了补充之前的工作，我们通过LA-ICP-MS证实了量子点在斑马鱼幼体中的生物积累和生物分布，并利用量子点的荧光特性，利用荧光显微镜评估了它们在HepG2细胞中的细胞内化动力学。获得的图像显示，照射12小时足以观察到量子点在HepG2细胞中的部分内化(图2)，24小时后内化达到最大值，而48小时和72小时后无显著变化(图2)。从所获得的图像也可以得出，CdSe/ZnS量子点的胞内定位降低到细胞质(图2)，但由于体积小，它们有能力穿透核膜，然而，我们在任何获得的图像中都没有观察到它们在细胞核中的存在；此外，量子点在72小时后仍然保持其荧光发射完整(图2)，这表明它们是稳定的，在测试条件下，它们在细胞内没有形成聚集。

我们通过透射电子显微镜获得较高的细胞定位分辨率，同时利用能谱仪(EDS)确认量子点的身份。大部分内化量子点位于细胞质中的液泡中(图3(A)和(B))，Cd在EDS光谱中的存在证实了这一点(图3(C))，因为没有其他可能的Cd来源，既不是生物的也不是由于样品处理，除了量子点自己。有趣的是，量子点也位于线粒体外膜(图3(D-F))，线粒体外膜也出现了结构损伤。当比较暴露于量子点的细胞中线粒体(图3(D))与对照细胞线粒体(图3(E))的形态时，可以观察到，暴露量子点后线粒体受损，只留下线粒体嵴的痕迹，这对线粒体基质的分区化至关重要，使其能够正确发挥其功能。正如之前荧光显微镜观察到的(图2)，尽管量子点很小(6 nm)，但在细胞核中没有发现。

图2 不同时间照射HepG2细胞后量子点的动力学及内化程度分析

量子点以红点的形式出现；细胞用鬼笔环肽(绿色)染色，用DAPI(蓝色)反染，荧光显微镜观察。

图3 CdSe/ZnS量子点照射HepG2细胞超薄切片的透射电镜图像

(A、B)位于液泡内的量子点。(C)能谱证实液泡内存在量子点。(D)位于受损线粒体外膜的量子点。(E)对照HepG2细胞线粒体。(F) EDS光谱证实线粒体外膜上存在量子点。

3. 体外定量蛋白质组学: SILAC实验

为了鉴定暴露于量子点后HepG2细胞中发生改变的蛋白，我们进行了两项大型SILAC实验(图4(A))，在直接SILAC实验中共鉴定出1168个蛋白，在反向SILAC实验中1165个蛋白，置信水平为99%(p < 0.01)。从鉴定的蛋白质中，有460个通过了定量标准，包括鉴定了至少两种独特的肽，Mascot值 >46 (p <0.01)。我们只考虑在两个重复样品中发现蛋白质，发现生物重复法的平均相对标准偏差(RSD)小于20%，结果具有较高的精密度。以1.30为阈值比值，我们共发现54个蛋白失调，其中过表达32个，抑制22个(表1)。正如预期的那样，大多数定量蛋白的RSILAC接近于1(图5(A))，表明大多数蛋白的丰度在量子点暴露后没有变化。我们利用基因本体论数据库对差异表达蛋白进行分类(图5(A))，结果表明CdSe/ZnS 量子点主要影响与蛋白质和RNA代谢、DNA修复、细胞防御机制以及细胞结构和形态有关的蛋白。

图4 CdSe/ZnS量子点毒性相关分子机制的综合蛋白质组学方法

(A)体外系统的细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)程序的一般方案。(B)以斑马鱼幼体为体内模型的super-SILAC程序总体方案。

表1 20mg/L CdSe/ZnS 量子点诱导HepG2细胞表达差异蛋白(SILAC实验)

4. 体内定量蛋白质组学:超SILAC实验

为了将使用暴露于量子点的HepG2细胞(SILAC实验)观察到的结果与体内模型相关联，我们设计并使用斑马鱼幼鱼进行了另一种定量蛋白质组学策略——超SILAC实验(图4(B))。我们从接触量子点的幼体中鉴定出291个蛋白，而在对照样品中鉴定出269个蛋白，均达到99%的置信水平(p < 0.01)。我们采用与SILAC实验相同的定量标准，而在这种情况下，由于体内模型更容易产生更大的变异性，我们选择了1.50的R_super-SILAC作为阈值，共发现28个蛋白解除调控，其中12个蛋白过表达，16个蛋白抑制(表2)。与在SILAC实验中一样，大多数定量蛋白的R_super-SILAC接近于1(图5(B))，表明大多数蛋白的丰度在量子点暴露后没有改变。我们根据它们所参与的生物学过程对差异表达蛋白进行分类(图5(B))，与SILAC实验结果一致，被改变的蛋白质参与与蛋白质代谢、防御机制、结构维护、运动和形态发生相关的过程。

表2 2 mg/L CdSe/ZnS 量子点诱导斑马鱼幼体表达差异蛋白(超SILAC实验)

图5 (A)已鉴定蛋白质的SILAC比和(B)超SILAC比的分布，以及从基因本体GO网站获得的差异蛋白质功能注释

讨论

本研究通过体外(HepG2细胞)和活体模型(斑马鱼幼体)两种不同的生物分析方法和两种定量蛋白质组学策略进行测试，这样不仅可以评价CdSe / ZnS量子点的潜在毒性效应，而且可以阐明量子点毒性相关的潜在生物分子机制(图6 )。

正如预期的那样，细胞活力随着量子点浓度的增加而下降。荧光显微镜观察表明，量子点的内化能力仅在24 h内就能侵入细胞质，并在72 h后仍保持稳定；此外，尽管量子点体积小，但却不能穿透核膜，这可能与观察到的毒性相对较低有关，特别是在低浓度下；另一方面，利用TEM结合EDS，可以鉴定主要在空泡和线粒体中内化的量子点，纳米颗粒在液泡中的位置是预料之中的，因为已经描述了纳米颗粒通过液泡积极参与的内吞机制。有趣的是，我们在线粒体的外膜中也发现了量子点，在这种外膜中观察到了明显的损伤，从结构上证明了量子点在这种细胞器中的毒性作用，从而对线粒体在细胞中的不同功能产生了影响。

以HepG2细胞为体外模型进行的SILAC实验(图6(A))显示了对结构蛋白和其他与细胞发育相关的蛋白的抑制作用，其中我们发现了负责合成其他蛋白质的蛋白质，例如RL27(R_SILAC=-1.47)。但是，也有一些蛋白质的功能发生改变，其功能是降解其他蛋白质，例如UBE2K(R_SILAC=-1.44)。其他被量子点抑制的蛋白具有与细胞生长和增殖相关的功能，如SRS3(R_SILAC=-1.36)。此外，我们发现参与肌动蛋白和微管蛋白(细胞骨架的主要成分)合成、生长和调控的结构蛋白在量子点暴露后发生了改变。蛋白质如CAPZB (R_SILAC=-1.39)，ACTG (R_SILAC=-1.33)和TBB4B (R_SILAC=-1.32)受到抑制。它们都是关键的结构蛋白，负责组织细胞内部提供机能支持，并参与细胞的通讯，运输，信号转导和迁移过程。

我们还报道了在评估CdS量子点毒性时观察到的线粒体损伤，这体现了纳米颗粒与膜蛋白相互作用的重要性并提示与线粒体毒性有关。在实验中，我们也观察到了同样的毒性作用。我们发现量子点与线粒体膜直接接触，明显受损(图3(D))。与此结果一致的是，来自定量蛋白质组学研究的数据证实了暴露于量子点的细胞线粒体内几个蛋白质的改变，其中许多与氧化应激的诱导有关。线粒体ACON (R_SILAC=1.36)是这些蛋白质之一，其功能是作为Krebs循环的一部分，将柠檬酸转化为异柠檬酸。在暴露于量子点的细胞中，ACON的激活表明线粒体氧化活性增加，从而导致氧化应激。在这个意义上，催化脂肪酸氧化的线粒体HCD2蛋白(R_SILAC=1.31)也过表达，这种蛋白质与线粒体应激有关，因为它促进活性氧(ROS)的合成和克雷布斯循环的激活。量子点对氧化应激的诱导也被其他同样上调的蛋白如PSME1 (R_SILAC=1.32)和PSD13 (R_SILAC=1.37)的存在所增强，这些蛋白属于蛋白酶体复合体，与异常ROS的产生有关。蛋白酶体复合物控制针对抗原和细胞内氧化剂水平的炎症反应，即这种蛋白复合物被ROS激活，但它也可能被谷胱甘肽(一种在细胞水平上应对氧化应激的重要物质)的消耗激活。量子点引起负责合成的蛋白GSH、GSHB (R_SILAC =-1.72)受到抑制，这种抑制对细胞产生负效应，使其对ROS引起的损伤更加敏感。量子点暴露导致ROS过量产生的另一个指标是STRAP的上调(R_SILAC=1.36)，该蛋白被氧化应激激活，参与触发与细胞增殖、迁移、凋亡或炎症反应相关的各种细胞反应机制。此外，众所周知，许多细胞对缺氧的反应是由呼吸链线粒体III复合体中ROS的产生介导的，因此量子点暴露后某些蛋白的表达上调可能提示暴露细胞缺氧的诱导，上面提到的ACON蛋白就是这种情况，因此，量子点暴露后某些蛋白的表达上调可能提示暴露细胞缺氧的诱导。上述的ACON蛋白或PDIA4 (R_SILAC=1.37)就是这样的情况，PDIA4是硫氧还蛋白家族的成员，被称为缺氧的细胞标记物。

我们还发现，CdSe/ZnS量子点暴露后，参与凋亡细胞死亡的蛋白表达上调。我们发现PDCD5 (R_SILAC=1.48)过表达，这种蛋白不直接诱导凋亡，但在凋亡细胞开始死亡时激活，加速了这一过程。VDAC2也有过表达(R_SILAC=1.43)。该蛋白的上调转化为细胞色素c和其他促凋亡因子(例如PDIA4(R_SILAC= 1.37))的释放，PDIA4除了是如上所述的缺氧标记外，还负责修复内质网中的受损蛋白，通常在氧化应激条件下，是线粒体功能障碍的指标。在高细胞毒性的情况下，PDIA4也可能通过凋亡诱导细胞死亡。在此背景下，我们在实验中发现了TDP-43 (R_SILAC=1.45)过表达，这种蛋白质参与RNA的形成、结合和运输的不同功能。然而，该蛋白的聚集与神经退行性疾病有关，其聚集与应激条件下的细胞死亡有关。结果表明，在我们的模型中，量子点暴露引起的细胞应激反应能够激活诱导毒性的分子通路，主要是通过上调TDP-43的表达和激活磷酸化hnRNPs蛋白所致(R_SILAC=1.30和1.41)。这些蛋白与过量的TDP-43相互作用，导致它们在应激颗粒中积累，产生对细胞有毒的蛋白聚集物，并可能诱导细胞凋亡。

在体内系统中，我们通过超SILAC策略验证了暴露于CdSe/ZnS量子点的细胞结构损伤和细胞能量机制发生功能障碍(图6(B))。在这种情况下，斑马鱼幼鱼被用作模型，以评估量子点暴露对发育中的有机体的影响。在体外模型中，对斑马鱼幼体发育至关重要的结构蛋白受到抑制，其中包括蛋白质如TBA1B (R_SILAC=-2.04)和TBB2 (R_SILAC =-2.70)。具体来说，TBA形成了神经元特定微管的一部分，抑制这些蛋白质会影响幼体的运动行为，但最重要的是影响大脑的正确发育。我们发现其他受到抑制的蛋白包括ACTN3B (R_SILAC=-1.92)，将非肌肉细胞膜结合到肌动蛋白丝上；还有肌球蛋白家族的三种蛋白质，它们也似乎被显着抑制了：SMYHC1 (R_SILAC=-1.52)，MYHs (R_SILAC=-1.61、-2.33和-5.88 )，MYLs (R_SILAC= -1.85和-10.00)。这些蛋白家族在斑马鱼的形态发生和肌肉发生，以及利用ATP产生身体运动中起着非常重要的作用。此外，在量子点暴露( R_SILAC= -2.56 )时，抑制肌球蛋白1和AT1A1也与肾功能衰竭有关，特别是肾小球的血浆滤过屏障问题；作为软骨和其他细胞外基质的一部分，MATN1蛋白(R_SILAC=3.85)在暴露于量子点的幼体中也出现了显著抑制。胶原蛋白(R_SILAC=1.61和1.92)是一种细胞外基质蛋白，在量子点暴露后表达上调，这种基质在斑马鱼体内的恢复使轴突得以大量生长，从而恢复运动能力。这些蛋白的过度表达可能反映了量子点效应影响机体部分再生机制的激活。根据上述一系列结果，我们发现斑马鱼幼体暴露在量子点下影响它们的发育以及器官形成。

我们在实验中发现由量子点影响而改变的其他蛋白质也可能对各种细胞功能产生负面影响，GRP78蛋白(R_SILAC=-2.17)就是这样的例子，它能够抑制组织因子蛋白，这种组织因子蛋白的激活通常与活性氧或缺氧的产生有关。TERA蛋白(R_SILAC=-1.85)的下调参与了多种细胞过程，也可能影响不同的细胞事件，包括降解泛素-蛋白酶体依赖蛋白、核膜重建、转录控制、细胞周期调控和受损DNA修复。量子点的毒性可能会影响其他功能，这是由于暴露在斑马鱼幼体中的AT2A1 (R_SILAC=7.21)高表达。该蛋白上调是钙离子缺乏的结果，这是关键的生理活动，如神经传递，肌肉收缩和骨重塑必不可少的。

在这些被发现的去调节蛋白中，人们期望找到与细胞防御机制有关的蛋白，HSP7C就是例子(R_SILAC =2.63)，负责监管防御机制对不同类型的压力或KRU (R_SILAC =1.80)，这种蛋白质参与能量交换过程和热休克蛋白激活过程，在应对外部环境时可能会影响机体的正常运转。另一种名为SPA (R_SILAC=2.28)的蛋白也上调，该蛋白作为早期免疫抑制作用在感染反应中被激活，因此，它的上调可能是由于量子点的内化。PDI的上调(R_SILAC=3.73)与氧化应激和缺氧导致的凋亡细胞死亡的起源有关，这与体外模型观察到的结果一致。在这个意义上，我们也观察到IDHP过表达(R_SILAC=2.58)。这种上调与Krebs的改变有关，因此，与线粒体功能障碍有关，它的主要功能是将异柠檬酸转化为2-氧戊二酸，这种Krebs循环的激活也可以解释为对量子点-诱导的缺氧的防御机制。 

图6 根据(A)SILAC法和(B)超SILAC法的结果推导出CdSe/ZnS量子点毒性的主要生物分子机制

结论

在本研究中，我们评估了CdSe/ZnS量子点在体外(人肝癌细胞)和体内(斑马鱼幼鱼)模型中的毒性作用。MTT结果表明，细胞活力以浓度依赖性的方式下降；荧光显微镜显示这些量子点在72 h后稳定，并验证了纳米粒子暴露24 h后逐渐内化在HepG2细胞中，并侵入细胞质；透射电镜获得的显微照片显示了这些纳米颗粒在细胞内液泡中的位置，并直接与线粒体接触；体外(SILAC)和体内(超SILAC)定量蛋白质组学实验已经鉴定出一组在量子点暴露后失去调控的蛋白质，这些改变的蛋白质使我们能够识别出与这些纳米颗粒相关的主要毒性机制。在体外模型中，量子点可以影响细胞结构和细胞发育，诱导氧化应激并激活其对外界应激的防御机制，它们诱导缺氧状态和ROS的产生，影响不同的代谢途径，如Krebs循环或脂肪酸的氧化；此外，由于这种应激和缺氧，我们推测量子点可能激活一种毒性机制，涉及TDP-43蛋白聚集的形成，与其他蛋白的过表达一起，触发凋亡细胞死亡机制的激活；另一方面，来自体内系统的量子点的毒性体现在证实了缺氧状态下一些线粒体蛋白的改变，以及诱导ROS生成和激活不同防御机制。我们发现抑制量子点暴露诱导的许多关键结构蛋白，可能导致胚胎发育和器官形成等相关问题，特别是与神经、肾脏和肌肉骨骼功能相关的问题。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33297139/