科研 | 四川大学：联合广泛靶向代谢组和转录组共同绘制番茄生长发育过程中的时空调控网络（国人佳作）
编译：微科盟矫情的农民，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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番茄被认为是研究植物次生代谢的模式植物，常见的植物代谢物，如类黄酮、类胡萝卜素、萜类和生物碱，都存在于番茄中，并与其生长习性和果实特性密切相关。尽管对番茄的一些多组学研究检测了营养组织，但大多数研究仍集中在果实品质上，因此，在整个番茄生长周期中发生的代谢和调控网络变化在很大程度上仍是未知的。为了确定番茄生长周期的代谢调控网络和潜在的转录调控，本研究开发了MicroTom代谢网络(MMN)，这是一个在不同发育阶段不同组织的代谢组和转录组数据集，我们在20组不同的组织和阶段检测了540个注释的代谢物和31,256个表达基因，利用这个数据集和实验策略可以为鉴定其他作物中重要代谢产物的关键调控因子提供有价值的参考。
论文ID
实验设计
实验结果
1. MMN数据集的生成
为了全面而准确的记录MicroTom番茄生命周期中的代谢调控网络的变化，本研究生成了MMN数据集（图1），该数据集包括了MicroTom番茄所有主要生长阶段和组织（以上20组材料）的转录组和代谢组数据，还包括从MicroTom番茄的平行代谢分析和组织收集的样本的所有主要生长阶段和转录组分析。我们收集了20个组织样本：收集的根、茎、叶样本来自于芽期（第一个花芽出现时，发芽后30天[DPG]）、开花阶段（有50%的花开放，45DPG），膨果阶段（第一个果实到膨果期时，85DPG），我们从芽期和开花期采集芽和花样本。除此之外，果皮来源果实发育的9个阶段：开花后(DPA)10天、20DPA、未成熟果实青(IMG)、成熟果实青(MG)、膨果（Br），膨果加3天（Br3），膨果加7天（Br7），膨果加10天（Br10）和膨果加15天（Br15）（图1）。我们对所有20个时间点/组织进行了3个生物重复分析，每一个都是来自10个植物的混合样本。
对于代谢组分析，我们通过基于广泛靶向的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的代谢谱分析方法对样品进行分析。代谢组共鉴定出540种不同的注释代谢物，包括70种类黄酮、76种氨基酸和衍生物、54种脂类、52种有机酸、50种核苷酸和衍生物、14种酚酰胺、32种生物碱、43种羟基肉桂酰和衍生物、9种多酚、13种碳水化合物、12种维生素、10种苯甲酸和衍生物、18种多胺以及87种不属于这13个主要类别的其他化合物(图2A)。对540种不同组织间代谢产物的分析表明，代谢产物可分为三大类:营养组织(根、茎、叶)、花组织(芽、花)和果实组织（整个果实发育过程中的果皮）中的代谢产物。这一结果表明，不同发育阶段的营养组织具有相似的代谢模式，但与果实组织的代谢模式存在显著差异。例如，代谢产物如脂类、生物碱、羟基肉桂酰衍生物和酚酰胺在营养阶段优先积累，而果实组织中氨基酸及其衍生物、类黄酮、核苷酸及其衍生物、有机酸、多酚和维生素的含量明显较高(图2A)。这些特定的代谢产物可能反映了番茄在营养生长和果实发育两个主要阶段代谢的空间差异。此外，我们进行了主成分分析(PCA)，将540种代谢产物进一步分为5组，每组都与特定的组织(根、茎、叶、花和果实)相关(图2C)，根据PCA，聚类树状图也可以分为5个独立的亚组(图2E)。这些结果表明，在番茄发育过程中代谢产物的积累具有组织特异性。
为了研究MicroTom番茄生长周期过程中的转录调控，我们构建了所有组织的时空动态转录组景观，生成了大约453Gb的原始数据。我们用独特的映射读取来计算每百万转录物的表达水平，在至少一个样品中总共有31，256个基因表达。为了在20个组织中形成基因表达的全局图像，我们制作了一个由基因聚类的Z评分标准化表达热图。此外，转录组的相关矩阵表明，无论发育阶段如何，整体基因表达模式都是组织特异性的(图2B)。当建立代谢组时，进一步的PCA和转录组的聚类树状图也显示了来自同一组织的样本在不同阶段的聚类(图2D和2F)。这些结果表明，基因表达和代谢产物积累在番茄发育过程中表现出显著的组织特异性。
图1 MicroTom代谢网络(MMN)的设计示意图
采集了3个关键发育阶段的20个样本进行代谢谱分析和RNA测序。轴表示样品收获日期(萌发后天数，DPG)。叶片(L)、根(R)、茎(S)、芽(F30)和花(F45)样品分别在芽期(30 DPG)、开花期(45 DPG)和破花期(85 DPG)收获。果实样品在花后10天(10DPA)、20DPA、未成熟果实青(IMG)、成熟果实青(MG)、膨果(Br)、膨果加3天(Br3)、Br7、Br10、Br15收获。
图2 代谢组和转录组检测结果分析图
A.鉴定到的代谢物热图；B.样本转录组的相关性图；C.基于代谢组的样本PCA图；D.基于转录组的样本PCA图；E.基于代谢组的样本聚类树状图；F.基于转录组的样本聚类树状图。对于代谢组数据（A），每行代谢物的Z评分标准化为-3至3。对于转录组数据（B），色标0-1表示Spearman的相关系数。（A）中的轴号表示组织：1-R30、2-R45、3-R85、4-S30、5-S45、6-S85、7-L30、8-L45、9-L85、10-F30、11 -F45、12-10DPA，13-20DPA，14-IMG，15-MG，16-Br，17-Br3、18-Br7、19-Br10、20-Br15。
2. 番茄的代谢组和转录组在不同组织和发育阶段的10个簇中相互调控
为进一步观察MicroTom番茄生长期间的代谢变化，我们使用k-均值聚类算法将所有540种带注释的代谢物根据其累积模式分为10簇（表1)。通过分析这10个簇，我们可以识别特定组织中富集的代谢物，如根(簇1)、茎(簇3)、叶(簇4)和花(簇5)(图3)。我们还确定了在开花和成熟果实阶段(第六组)之间减少的化合物，以及在绿色果实阶段(第七组)和果实成熟阶段(第十组)增加的化合物。此外，有些化合物在两个以上的组织或阶段中(第二、第八和第九组)(图3)。
为了将基因表达模式与代谢物积累联系起来，我们对代谢组和转录组数据进行了共表达分析，共鉴定出17003个基因与至少一种代谢物存在极显著的相关性（r>0.8）。
然后，根据皮尔逊相关系数以及在番茄发育过程中表达模式一致的情况，我们将540个代谢物和17003个基因分成10个共表达簇(图3)，发现去除与540个代谢物相关性较低的基因后，其余17003个共表达基因的PCA和聚类分析呈现模式与整体基因表达相似。这表明，在正常的生长周期中，番茄基因表达的模式与主要代谢途径的趋势是一致的。
表1 本研究中鉴定的化合物和基因的分布不同的集群
图3 MicroTom番茄生长周期中代谢物和基因的动态表达模式
K-means聚类将番茄代谢组（红色）和转录组（蓝色）的表达谱分为10个簇。x轴描述了3个关键发育阶段的20个样品，y轴描述了每种代谢物（红色）和基因（蓝色）的标准化Z值。每个框中显示的数字（例如，簇I的67个代谢物和4,543个基因）是基于每个簇中所有20个样品中的代谢物和基因的数目得出的。 轴号表示组织：1-R30、2-R45、3-R85、4-S30、5-S45、6-S85、7-L30、8-L45、9-L85、10-F30、11-F45、12 -10DPA，13-20DPA，14-IMG，15-MG，16-Br，17-Br3、18-Br7、19-Br10、20-Br15。 总共确定了十个集群。
3. 已知代谢调控网络分析
为了检验MMN是否能提供对番茄代谢调控网络的时空洞察，我们首先用以前已知的调控网络进行了测试。类黄酮的生物合成是苯丙素途径的分支，该途径以苯丙氨酸的形式提供前体。在苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查尔酮合成酶(CHS)催化的反应之后，类黄酮途径由一系列酶组成，这些酶催化各种下游反应，从而导致苷元主干的生物合成(图4D)。在过去的20年里，类黄酮生物合成一直是一个不断发展的研究领域，在识别生物合成基因及其调控因子方面取得了很大进展。多种MYB家族转录因子已被鉴定为类黄酮生物合成的调节因子。已有研究表明，类黄酮修饰基因SlF3’5’h的表达与花青素生物合成转录因子SlMYB75在营养组织中的表达相关，而与类黄酮生物合成的主要调节因子SlMYB12无关。
本研究对类黄酮合成基因和相关转录因子的RNA-seq数据显示，SlF3’5’h与SlMYB75共表达极显著，而与SlMYB12共表达不显著(图4A和4B)。RT-qPCR分析结果与RNA-seq数据高度一致。SlMYB75可以与SlF3'5'H的启动子区相互作用，诱导比SlMYB12诱导的表达量高得多(图4C)。此外，本研究还对SGA及其生物合成相关基因进行了分析，发现已报道的GAME基因簇存在于簇V中。以上均说明代谢物的产生与转录组的变化之间存在良好的相关性，并且提示MMN可以用于研究番茄重要代谢通路的调控。
图4 番茄类黄酮合成调控分析
A.转录因子和结构基因的共表达网络图；B.类黄酮通路相关基因在不同样本中的表达模式；C.荧光素酶报告基因显示SlMYB75能更好地诱导SlF3’5’H启动子的活性；D.番茄中类黄酮的生物合成和调控示意图。紫色箭头表示受SlMYB75调控的基因和代谢产物，橙色箭头表示受SMYB12调控的基因和代谢产物。
SGA生物合成始于糖酵解，然后是甲羟戊酸和环蒿醇途径。胆固醇途径提供胆固醇，胆固醇是SGA途径的前体，植物甾醇途径与胆固醇途径重叠。从胆固醇来说，有一系列的酶催化生物合成途径中不同的下游反应。先前的表达分析确定了形成从胆固醇到α-番茄碱的生物合成途径的聚集的GLYCOALKALOID代谢基因(GAME)。此外，我们发现AP2/电流变流体转录因子SlGAME9正向调节SGA生物合成。在540种代谢物中，我们检测到29种主要存在于第三、第五、第六和第十簇中的SGA；并且，我们在第五组中鉴定了三个SGA(去氢纤丝菌素、去氢番茄碱和去氢番茄碱异构体(25R))和15个SGA相关基因。其中，SGA生物合成基因(SlGAME1、SlGAME4、SlGAME6、SlGAME11、SlGAME17和SlGAME25)与调控基因SlGAME9共表达良好，这一结果与以前对GAME基因簇的共表达分析完全一致。我们还对这些基因进行了逆转录-定量聚合酶链反应分析，并确定它们主要在营养组织中增加，在果实发育过程中减少。总之，利用MMN，我们可以完美地验证之前已知的番茄生长周期中的代谢调控网络。
4. 一种新的调节甾体糖生物碱代谢的转录因子的鉴定
考虑到防御性化合物对番茄生长和果实品质很重要，本研究尝试使用MMN来确定控制SGA生物合成途径的新调控因子。首先我们发现在V簇中有15个SGA相关基因(SlGAME9和14个生物合成基因)与3个SGAs共表达，对该簇进行搜索，发现编码bHLH转录因子的基因(Solyc01g096370)也与这些SGAs和代谢基因共表达极显著。进一步的研究表明，Solyc01g096370与已知的调控因子SlGAME9有大量共同调控的代谢物和基因。京都基因与基因组百科全书(KEGG)对常见基因和代谢产物的分析显示，其分子功能主要富集于甾体和生物碱的生物合成，提示Solyc01g096370具有潜在的SGA通路调节功能。有趣的是，Solyc01g096370与SGA通路的相关性水平与SlGAME9相当(图5A)。
系统发育分析显示，Solyc01g096370编码的bHLH家族蛋白属于MYC家族，主要参与茉莉酸类信号传导。进一步分析表明，Solyc01g096370为SlbHLH114，Solyc01g096370属于bHLH亚家族15，与茉莉酸类信号转导和茄属植物VI型腺毛的发育有关。此外，SlbHLH114与拟南芥亚科8聚在一起，其在茉莉酸信号转导途径中起作用，并影响根毛和毛状体的形成。这些数据表明SlbHLH114可能参与SGA代谢和JA信号传导。
我们接下来分析了SlbHLH114在不同发育阶段和不同组织中的表达水平。转录组分析显示，与已知的SGA生物合成基因和代谢物一样，SlbHLH114在营养组织中表达量较高，在果实发育过程中逐渐降低，当果实成熟后，表达量迅速下降。RT-qPCR分析证实了这种表达模式下亚细胞定位显示SlbHLH114仅位于细胞核中。
为研究SlbHLH114的潜在功能，我们构建了在果实特异性E8启动子驱动下过表达SlbHLH114的转基因番茄植株。我们获得了17株T0植物，其中成熟果实中SlbHLH114的表达水平显著高于MicroTom。我们选取C和I株进一步表征T1(图5B、5D)，对WT和T1代E8:bHLH114 C和I株的Br3期果皮样品进行了RNA-seq分析(图5B)。E8:bHLH114 C和I有很大比例的诱导基因共享，包括SGA生物合成途径中的许多基因和代谢物(图5C)。与同一时期的MicroTom番茄果实相比，有2851个基因在两个过表达株系中均上调，2153个基因表达下调(FC≥1.5)。
KEGG富集分析表明，上调的基因参与信号转导、植物-病原体互作以及与SGAs相关的次生代谢产物的生物合成。RT-qPCR分析证实了这一观察结果；总的来说，在两个E8:SlbHLH114株系中，涉及糖酵解和甲戊酸、环戊烯醇、胆固醇、植物甾醇和SGA通路的基因均上调。Br10果皮样品的代谢谱显示，两种转基因株系积累了大量的SGAs(主要是番茄碱、羟基番茄烯胺等)(图5C)。综上所述，SlbHLH114在番茄果实中过表达促进了SGA的积累。
为了进一步研究SlbHLH114是否直接诱导SGA生物合成基因的表达，本研究利用拟南芥原生质体进行了双荧光素酶报告基因检测，我们克隆了参与胆固醇前体途径(SlSSR2和Sl7-DR2)和SGA生物合成途径(SlGAME4)的三个SlbHLH114诱导的生物合成基因的启动子，使用SlGAME9作为阳性对照，结果显示当SlbHLH114表达时，这些启动子的活性都显著高于对照(图5E和5F)，证明了SlbHLH114是SGA生物合成途径的阳性调节因子。此外，通过共表达分析、拟南芥原生质体双荧光素酶试验等，我们发现当SlbHLH114表达时，这些启动子的活性均显著高于对照(图5E和5F)，说明SlbHLH114不能直接调控之前被报道的SGA生物合成关键调控因子SlMYC2的表达。
此前，SlMYC2(Solyc08g076930)被报道为SGA生物合成的关键调控因子。我们对SlMYC2与SGA相关基因进行共表达分析，发现SlMYC2与已知的SGA基因不能很好地共表达。相反，它与JA信号基因有很强的相关性，这与它在调控JA信号中的重要作用相一致。我们进一步使用MMN数据集以及先前发表的SGN-TEA (http://tea.solgenomics.net/overview)和TomExpress数据集(http://tomexpress.toulouse.inra.fr/)对SlMYC2和SlbHLH114进行共表达分析，在所有三个数据集中，SlMYC2和SlbHLH114之间没有显著的共表达模式。
SlMYC2和SlbHLH114属于bHLH亚科15，为了探讨SlMYC2和SlbHLH114之间可能的相互作用，我们在拟南芥原生质体进行了双荧光素酶报告基因检测，发现probHLH114可以被SlMYC2激活，表明SlbHLH114是SlMYC2的靶标。另一方面，我们检查了之前发表的SlMYC2相关工作，发现在SlMYC2-RNAi植物中，SlbHLH114的表达明显低于WT植物，这证实了SlMYC2对SlbHLH114的潜在调控作用。相比之下，在使用拟南芥原生质体进行的双荧光素酶报告基因检测中，我们未观察到SlbHLH114对proSlMYC2的显著诱导。此外，在我们的E8:bHLH114和WT果实的RNA-seq数据中，SlMYC2的表达水平无显著差异。这些数据都表明SlbHLH114不能直接调控SlMYC2的表达。
图5 甾体生物碱的合成调控
A.甾体生物碱生物合成途径的共表达网络，代谢物，结构基因和转录因子分别标记为粉红色，浅蓝色和红色；B.转基因和MicroTom番茄果实在不同阶段的表型；C.E8:SlbHLH114相关的番茄果实的基因和代谢物变化，根据转录组和代谢组数据，对在转基因果实（C系和I系）中显着增加的基因和代谢物进行了着色；D.来自两个独立的T1代系和MicroTom在Br3处的SlbHLH114的表达水平；E.启动子激活实验的示意图，将启动子克隆到双重萤光素酶报告载体中，以激活萤光素酶（LUC）的表达，由CaMV 35S启动子驱动的海肾（REN）用作内部对照；F.SlbHLH114直接与通路中的基因的启动子相互作用。
5. 一种新的调节类黄酮代谢的转录因子的预测
使用同样的策略，本研究使用MMN来扩大对调节类黄酮代谢的转录因子的研究。类黄酮类代谢物和生物合成基因共表达分析时，除了已知的基因SlMYB12之外，还有一个基因(Solyc02g077790)编码，这种基因编码是一种与黄酮类代谢途径更好地共表达的APETALA2/乙烯反应因子(AP2/ERF)转录因子(图6A)。我们发现Solyc02g077790与SlMYB12有大量共同表达的基因和代谢物（图6），而通过对常见基因和代谢物的KEGG分析，我们发现其分子功能主要富集于类黄酮和苯丙烷类生物合成，暗示Solyc02g077790可能调节类黄酮途径。
系统发育分析得到Solyc02g077790蛋白属于乙烯反应因子G亚群，并命名为SlERF.G3-like，SlERF.G3-like在果实组织中特异性表达，在Br3达到最高表达，类似于主要类黄酮生物合成基因和代谢产物的表达模式，亚细胞定位表明其位于细胞核和细胞质中。
为研究SlERF.G3-like功能，我们从果实特异性E8启动子产生了过量表达SlERF.G3-like的转基因切片机植物，获得了14个独立的E8:SlERF .G3-like过表达系，其中两个代表性系(系12和36)被选择用于进一步研究。然后，我们在Br3阶段对SlERF.G3-Like-12、SlERF .G3-Like-36和WT果皮样品进行了逆转录-定量聚合酶链反应分析，发现两个转基因品系中类黄酮生物合成基因的表达显著增加，包括SlCHS1、SlCHS2、SlCHI、SlF3H、SLF3’H和SlFLS。随着生物合成基因表达的增加，我们对Br7期果实的液相色谱-质谱分析显示，主要黄酮类化合物和中间体(柚皮素、谷精草素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香苷)的含量显著增加。我们进行了转基因试验，发现E8: SlERF . G3-like果实为橙色，我们还检测了类胡萝卜素生物合成基因的表达，与切片机相比，E8: SlERF .G3-like -36果实中类胡萝卜素生物合成基因没有显著减少，这与我们之前对富含类黄酮的番茄的观察相吻合。所有这些数据表明，E8: SlERF .G3样果实的橙色主要是由于类黄酮化合物的积累而不是类胡萝卜素合成受到抑制。
为了直接对比SlERF.G3-like和已知的类黄酮生物合成调节剂SlMYB12的功能，我们通过拟南芥原生质体中的双荧光素酶报告基因分析了主要黄酮醇生物合成基因(SlCHS1、SlF3H和SlFLS)的启动子。结果表明，SlMYB12和SlERF能显著诱导三种启动子。此外，当两种转录因子结合时，受试启动子的活性可以进一步提高。然而，由于16SlMYB12的表达水平在E8:SlRf.G3-like果实中与WT相比没有显著变化，SlRf.G3-like果实的转录物丰度在过度表达果实的AtMYB12(与SlMYB12同源的拟南芥)中是不变的，所有这些数据表明，尽管两种转录物都能上调类黄酮生物合成，但SlMYB12和SlRf.G3-like之间没有直接的相互作用。
我们检测了SlMYB12和SlERF.G3-like蛋白在Br3处的果皮和果肉中的表达。与主要在果皮中表达的slmyb12相比，SlERF.G3-like的表达在果肉中被显著诱导；另一方面，在MMN、SGN-TEA和TomExpress数据库中观察到这两个基因的低表达相关性。所有这些数据表明，这两种转录因子可能独立地调节番茄果实中黄酮醇的生物合成。
通过双荧光素酶报告试验,我们发现SlMYB12和SlERF.G3-like均能显著诱导SlCHS1、SlF3H和SlFLS启动子的表达，而SlMYB12和SlERF.G3-like之间没有直接的互动，两个TFs可能在番茄果实中独立调控类黄酮的生物合成（图6）。
总的来说，这些数据表明SlERF.G3-like是番茄中调控类黄酮生物合成的潜在转录因子。利用MMN数据集，我们可以发现在番茄生长周期中运行的代谢调控网络，并验证主要代谢途径的新调控因子。
图6 类黄酮合成通路上的新转录因子
A.类黄酮代谢途径中关键基因和代谢物的共表达网络，代谢物，结构基因和转录因子分别标记为浅粉红色，蓝色和灰色，计算每对基因/代谢物的皮尔逊相关系数（PCC）值；B.转基因和MicroTom番茄果实不同发育时期的表型；C.转基因和野生型番茄中SlERF.G3-like的表达量；D.E8：S1ERF.G3-like过表达系中的基因和代谢物表达情况。
讨论
我们在此对20个样本的代谢组和转录组进行了综合分析，涵盖了番茄的主要组织和生长阶段。本研究生成的MMN数据集包括在至少一个组织或阶段中检测到的540种代谢物和31，256种表达基因的数据。基于我们对组织和阶段中代谢物和转录物丰度的全局模式的分析，我们确定了540种代谢物可被分成10个簇，并且17，003个基因与540种代谢物中的至少一种共表达(r≥ 0.8)，占番茄基因组中预测的蛋白质编码基因总数的54.4%。另外，我们发现这17，003个基因的表达模式代表全球基因表达模式(图2D、2F)。
由于我们在本研究中使用的广泛靶向液相色谱-串联质谱的检测限，仍有化合物，如类胡萝卜素和萜类化合物，尚未在我们的样品中定量。因此，除了我们确定的十个代谢物簇之外，未来对相同样品的代谢组学分析可能会揭示本研究中未包括的化合物和代谢途径的新积累模式。一旦我们有了这些信息，与代谢物共表达的基因数量可能会进一步增加，这为彻底研究番茄中调节代谢途径的遗传网络提供了丰富的资源。
我们的MMN数据集也是当前番茄多组学资源的一个很好的补充。以前的研究主要集中在比较不同个体之间的特定组织，这提供了遗传变异和代谢变化之间的高分辨率相关性。然而，如果一种化合物或途径在取样组织中没有表达，就很难分析其调控网络。通过覆盖番茄的大多数组织和发育阶段，MMN数据集提供了番茄整个生长周期中代谢和转录动态的高分辨率地图。我们用来分析切片机生长周期的策略可以用来指导未来比较不同物种和种质的实验设计。使用MMN数据集，我们构建了番茄生长期间代谢变化的全局图，包括以下内容：营养期和生殖期之间的显著代谢变化(图2A)；在果实成熟期间，营养化合物(如类黄酮)增加到成熟阶段的高水平(第十组，图3和表1)；以及营养组织和未成熟果实中的高水平抗营养化合物，例如SGAs，其在果实成熟期间显著下降(图3)。MMN能够捕捉到这些和其他重要代谢变化背后的转录变化，并为代谢调控的全面研究提供了有价值的资源。
使用MMN数据集，我们能够验证一些先前已知的代谢调控网络，并识别可能调控番茄代谢的新转录因子。先前的研究已经确定SlMYB12和SlMYB75是类黄酮途径的调节剂。玉米(Zeamays L.)叶色(LC)和无色1(C1)基因或atmyb12(SLMYB 12的同源物)在番茄果实中的表达阻止了SLF 3’5’H的诱导，导致果实积累了更高水平的黄酮醇但没有花青素。然而，当SlMYB75或AmDel/AmRos1在番茄中表达时，SLF3’5’H表达被激活，果实中产生花色素苷。在我们的研究中，我们验证了SlMYB75主要存在于叶片中，并控制3-羟基类黄酮的产生，据报道，这有助于紫外线防护和病原体抗性。
MMN数据集也为筛选类黄酮途径的其他调节因子提供了全面的基础。这导致了SlERF.G3-like的鉴定，一种新的ERF转录因子。我们发现SlERF.G3-like基因的过度表达可以激活主要类黄酮生物合成基因(如SlCHS1、SlF3H和SlFLS)的表达，从而提高类黄酮的产量(图6）。另外，SlERF.G3-like可能单独作用于已知的类黄酮调节因子SlMYB12。所有这些数据表明SlERF.G3-like是番茄果实类黄酮生物合成的新调控因子。
MMN数据集也被证明是一个有用的工具，用于研究防御化合物生物合成的调控网络，如SGAs。GAME1催化甾体生物碱的糖基化并调节其毒性。最近在番茄中的研究发现，Jasmonate-ResponsiveERF转录因子(如JRE4)或SlGAME9参与调节SGA水平。在MMN中，代谢物的积累和调节其生物合成的转录因子在番茄生长周期中与其生物学功能完全匹配(图3)。对MMN数据集的筛选使我们能够识别SlbHLH114，与SlGAME9相似，SlbHLH114可以显著诱导SGA生物合成基因的表达，在番茄果实中过量表达SlbHLH114可以提高主要SGAs的产量(图5)。所有这些数据表明bHLH114是一种参与调节SGA途径的新型转录因子
总之，我们的MMN数据集提供了番茄生长周期20个不同组织/阶段时空高分辨率代谢组和转录组数据集。它提供了番茄生长周期中主要代谢变化的全局视图，以及这些变化背后的转录调控。使用这个数据集，我们将能够验证代谢调节的其他重要模式，并识别控制这些途径的新转录因子。综上所述，MMN数据集提供了对主要番茄代谢物转录控制的见解，并为未来的质量改进提供了指导。