科研 | 剑桥大学：利用相分离有效恢复RNA结合蛋白组或者蛋白结合转录组
编译：小北，编辑：Emma、江舜尧。
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RNA-蛋白相互作用在细胞内稳态和疾病中发挥着关键的作用，但是现阶段的研究方法需要相当量的原始材料以便回收一组RNA品系或者复合体，并且相当耗时。研究者开发了一种正交有机相分离的方法（OOPS）：一种快速、有效并且可重复的方法能够以无差别的方式将交联的RNA-蛋白加合物进行纯化。OOPS避免了分子标签或者捕获聚腺苷酸RNA。相反，它是在标准的TRIzol分离到RNA-结合蛋白（RBPs）富集之间取样并且它们同源结合RNA。OOPS的特异性是通过RNases消化的富集界面或者蛋白酶释放的RBPs或者蛋白结合RNA分别实现的。在本文中研究者呈现了从同一样本中纯化蛋白-RNA加合物、游离蛋白质以及游离RNA一步步的方法，并且进一步描述了OOPS如何应用到人类细胞、拟南芥、裂殖酵母、大肠肝菌中，以及它如何用来研究RBP的动力学。
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前言
RNA-蛋白之间的相互作用调节RNA生命的整个过程，从转录到成熟、转运、定位以及降解。RNA和RBPs之间动态的相互作用形成了功能型的核糖核蛋白（RNP），随后实施广泛的细胞功能。掌握RNAs和RBPs之间内在的联系对于理解RNA调节细胞生理至关重要。的确，RNA-蛋白之间相互作用的异常调节在一系列疾病中非常重要，包括脊髓性肌肉萎缩症、肌萎缩性侧束硬化症以及一系列肿瘤，对于基于核酸的疗法可作为前景的靶向。不幸的是，对这种相互作用从无差别的全系统景观描述方法的缺乏限制了对细胞内稳态方面的探究。研究者近期开发的OOPS方法能够解决这个不足，以无差别的方式全面的分析RNA结合蛋白组。OOPS结合UV交联来固定RNA-蛋白之间的相互作用，利用AGPC（又称为TRIzol）提取富集RNA-蛋白加合物。在正常的AGPC提取条件表，未交联的RNA分割到了最上层的水相，而未交联的蛋白分割到了最底下的有机相。交联的RNA-蛋白加合物同时具有RNA和蛋白质的物理化学特性，因此停滞在中间层并且通过AGPC分离的重复操作富集。富集的蛋白结合RNAs（PBRs）或者RBPs通过酶消化恢复（图1）。
图1 OOPS工作流程图细胞被UV交联（254nm），RNA、蛋白质以及RNA-蛋白质加合物依据它们的物化特性被分离。RNA结合的蛋白质或者蛋白结合的RNA可能被重新消化加成物的相应部分，RNA以线条展示，蛋白以实心表示。
OOPS直接应用到任何能够接受UV交联的生物系统，独立于RNA的聚腺苷酸状态，因此适用于研究非编码RNA-蛋白之间的相互作用以及原核生物的RBP组学。此外考虑到低产量的需求以及可靠性，OOPS能够结合多个蛋白组学定量的技术来阐释在动态条件下RBP的突变体。
实验结果
1. 技术的发展
OOPS技术的发展在Queiroz等人的研究中有详细的报道。为了解释OOPS在恢复RBPs时任何可能的差别，研究者将UV交联、AGPC分离后的中间层进行了RNA测序，并且发现全长(>200核苷酸)的转录组是结合蛋白质的，提示在任意特定的RNA种系中都是无差别的。从蛋白质的角度，该方法的特异性可通过细胞培养过程中氨基酸稳定同位素标记(SILAC)对蛋白组学定量进行检测。研究者发现UV交联能够提高中间蛋白质的丰度，并且中间位置重复的AGPC分离更加富集了UV交联的蛋白。为了特异性的恢复中间与RNA相互作用的蛋白，研究者利用RNases处理了中间层，在接下来的相分离中恢复的蛋白质释放到了有机相。显著的是，中间层超过95%的蛋白是对RNase敏感的，这充分的说明RBP组的高度特异性富集。
研究者利用OOPS捕获胚胎的（HEK293）、肿瘤衍生（U2OS）以及非肿瘤衍生（MCF10A）人类细胞系以及细菌(E. coli)，恢复了原核生物第一个RBPomes，说明了OOPS的多效性。研究者将OOPS应用到动态的框架，在微管解聚细胞停滞的条件下恢复了整体的蛋白质组和RBP组学。此外，通过比较整体的蛋白组学和RBP组学，研究者可以区分RNA结合活性的变化是RBP丰度的变化引起的。
2. OOPS方法的应用
OOPS从同一样本中恢复游离的RNA和蛋白质以及UV交联的RNA-蛋白加合物。这项技术最明显的应用是通过RNA测序和基于MS蛋白组学方法从全系统的景观对这些相互作用进行阐释。然而，交联的蛋白质-RNA加合物同样可能作为更多特异性研究的原材料。结合部分蛋白消化以及基于silica对肽段-RNA加合物的富集，交联的肽段可被用于确定RNA结合的结构域或者区域。此外，中间层部分可结合其他技术（如基于CLIP的技术），利用交联的蛋白质-RNA纯化样本简化实验方法。此外，由于OOPS恢复的所有RNA是交联蛋白知道，可结合基于oligo(dT)的mRNA结合蛋白恢复方法，捕获RNA相互作用组（RIC）以从非编码的RNA结合蛋白中区分mRNA结合蛋白质。
3. 与其他方法的比较
RBPs的高通量确定由基于RIC的方法确定，RIC已经证实对不同真核生物系统中RBPs的分类是有用的，但是对聚腺苷酸化的RNA结合蛋白是明显有偏差的，当聚腺苷酸化RNA缺乏时妨碍了对RBPs的全面分类或者应用。利用UV交联和相分离来分离RBPs的选择性方法有XRNAX和PTex，尽管这三种方法有一些重要的差异。OOPS需要的原始材料最少(对于人类细胞：OOPS ~3 × 106, PTex ~5 × 106，XRNAX ~8 ×107)。由于并未进行直接的比较，每种方法相对的优势和劣势不能确定。
4. 实验设计
OOPS的开发有两个目的：为了对任意生物体内RBPs进行全面的分类以及研究RBP组的动力学。目前已经应用到真核和原核细胞，黏连的和非黏连的细胞培养以及有无细胞壁的细胞。典型的OOPS实验包括UV放射形成蛋白-RNA加合物、细胞裂解、相分离重复以富集加合物以及蛋白质或者RNA的恢复。在不同的生物系统中所有的修饰都需要实施到实验方法，同样重要的OOPS步骤在图2中做了详细的说明。
图2 OOPS工作流程图示方法的步骤和完成时间结合OOPS中RNA和蛋白的图解形式展示，同时在右侧对步骤有一个简要介绍。完成每一步的时间依据细胞的类型（步骤1-3）以及短时或者过夜消化的选择（步骤69-90以及91-101）。
5. 原始材料
通常，在中间层包含更多物质时OOPS更易操作。中间层的物质依赖于原始材料的质量、RNA-蛋白质交联的效果以及细胞裂解的成分，如需要在实验过程中优化补充。过量体积的中间物对于分解、纯化以及消化是困难的。当在一种新的物种或者组织中进行OOPS，UV剂量和原始材料需要优化。此外，在含细胞壁的个体中，以RNA或者蛋白质兼容的方式进行细胞裂解需要优化。
6. 对照
OOPS的模块化允许合并不同的对照提高确定的RBPs或者RNA结合中变化的可靠性。当在新的生物模型中对RBPs进行分类时，优先使用SILAC的对照。将SILAC标记UV交联的细胞或者未交联的细胞、细胞裂解阶段的混合样本经OOPS富集的蛋白质丰度进行比较，是对RBPs分类的经典方法（图3）。对照组在一定程度上评估了利用OOPS进行蛋白分离是依赖UV的。OOPS在生物学重复组中保持一致的RNA量。因此，可利用SILAC将RNase+/−处理后混合的OOPS中间层进行RNA降解的选择性对照（图3）。对照组在一定程度上评估了在最后干净的中间层蛋白质的出现是依赖于RNA的。对于合并稳定同位素编码氨基酸的生物学系统并不是一个合适的选择，一个单独的最终的OOPS中间层可被分裂成RNAse +/−的样本并且经过无标签定量LFQ分析，为OOPS富集蛋白质的RNA结合状态提供定量的证据，虽然没有SILAC准确。同样的，分离的非交联以及RNase阴性对照的样本可通过免疫印迹检测。
图3 不同SILAC对照与OOPS流程图示UV交联以及RNase的SILAC对照可在步骤的对应阶段加入，红色的箭头代表结合样本的步骤（步骤3是非交联的对照，步骤75是RNase阴性的对照）。对于非交联的对照，在细胞裂解液阶段进行混合（上部）。对于RNase阴性对照，在最终相分离之前将清理的中间层混合（下部）。
7. RNA结合蛋白的动态学
OOPS更易适用于都通过定量比较不同条件下RBPs整合RBP的动态学。例如基于TMT的分析被应用于阐释微管解聚细胞停滞条件下RBP的动力学。TMT允许高度复用的能力，降低了质谱分析的时间以及每个样本在独立的液相以及串联质谱(LC−MS/MS)比较中错失的信息。RBP组学的动力学研究通过同时定量整体的蛋白和RNA结合蛋白的丰度来特异性的确定RNA结合发生改变的RBPs，与不同丰度下确定RBPs相对（图4）。从同一样本中获取整体的蛋白组学和RBP组学信息建议降低混杂因素和批次效应。实验框架可补充以研究其他实验条件下RBP组学的动态学。当达到三个分析条件时，在不同条件下整体以及RNA结合蛋白的SILAC定量对于TMT定量是容易实施的。
图4 TMT实验设计流程在TMT实验中加入不同的处理（t），整个蛋白组学可从全部的裂解液中获得、TMT标记以及与单一样本结合。不同的RBP组学可独立获得、标记并且与第二个样本结合。
8. MS的技术考虑
OPPS技术是一项高度有效的RBP富集技术，数以百计蛋白的阴性对照不能检测到信号。当利用SILAC对UV交联和未交联的对照进行RBPs相对丰度的定量，一些肽段也仅在交联样本中观察到。研究者因此提示可调整MS背景以检测SILAC对，以避免MS2错过这些在交联样本中高度富集的肽段。
商业化可应用的TMT试剂盒相较于RBP富集可标记更多量的肽段。在研究者的项目中，将一个0.80-mg TMT标签的小瓶等体积分成两份标记RBPs和整体的蛋白分离物(分别~10−25 μg和15−40 μg)取得了令人满意的结果。当处理低反应体积的RMT标记，维持TMT标签和肽段的正确浓度是非常重要的。同样值得注意的是TMT的定量将低估倍数的变化，利用Orbitrap质谱仪与SPS-MS3可并且保留排除的肽谱与共分离的证据匹配而减弱。
9. 局限性
在变性的条件下所有恢复RNA-蛋白相互作用的方法都需要先稳定这些相互作用。目前UV交联是一种“黄金标准”的方法以零距离共价稳定RNA-蛋白之间的相互作用。然而，有报道称在剂量高于1 J/cm2，UV-C能够诱导产生单链的DNA-蛋白和蛋白-蛋白加合物，这些加合物并不限制在OOPS的中间层，加合物中的一半更倾向于分离到有机层。研究者建议根据选择的生物系统评估需要UV的最适值（步骤2）。由于OOPS需要RNA-蛋白质之间的相互作用是稳定的，因此只适用于能够接受UV交联的生物系统。
OOPS可能用于通过同源大分子的酶连水解获取RNA结合蛋白质组以及蛋白质结合转录组。然而结合的转录组或者蛋白组保留它们对应的特性，这将影响下游的分析。例如，在蛋白酶消化后，一个或多个氨基酸可能仍然与蛋白结合的转录组交联。残留的氨基酸干扰一些反转录酶，影响cDNA的合成和最终RNA的定量，特别是考虑到全长cDNA。因此需要利用片段RNA进行反转录。在交联位点覆盖的缺失仍然能被检测到。影响转录的定量。如果研究者想从read覆盖率的缺失推断交联位点，这可能提供了有用的信息。从RBP组学的角度，交联的蛋白在基于大小的电泳中迁移不同，除非RNA被完全消化。此外，最常见的利用肽段光谱与算法匹配并不能控制过多的氨基酸和核苷酸，结果交联的肽段不能被直接检测到。同时这一限制也能作为优势，因为它允许使用定制开放的搜索引擎直接确定交联的肽段以及蛋白的交联位点。
最终研究者发现相分离方法能够在中间层富集一组多糖蛋白不依赖于它们RNA结合的状态。这些多糖蛋白可以利用RNase以及交联的阴性对照样本进行确定，但是在数据分析时需要将多糖肽段排除。
10. 预期结果
该方法适用于从同一样本中恢复蛋白交联的RNA（步骤46）以及非交联的RNA（步骤7），以及RNA交联蛋白（步骤90）和非交联的蛋白（步骤9）。
在蛋白酶K处理后，在琼脂糖凝胶或者生物分析对交联和未交联RNA的RNA图谱应该相似（图5a）。然而由于残留的氨基酸与RNA相连，核糖体RNA的峰图区域更宽。当交联时微小的峰图可能在18S一下出现，并不影响转录的结果。在未交联样本中中间层RNA的数量不代表交联样本中间层超过2-5%的RNA（图5b）。若超过5%的被检测到，参照“故障检测”（表1）。
图5 OOPS RNA恢复（a）在蛋白酶K消化后，非交联（NC）和交联的（CL）样本水相和中间层典型的生物分析仪RNA图谱；（b）左侧代表1%琼脂糖凝胶中的图像发现主要的核糖体RNA条带，每个柱中UV的剂量（上部：水相，游离的RNA；下部：中间层，蛋白结合的RNA）；右侧利用Nanodrop (n = 3)测量不同UV剂量下RNA交联的相对比例。
获取RNP复合体最受限制的步骤之一是对交联效率的优化。交联效率可能被暴露在不同长度UV下中间层RNA的比例影响。PBR%=中间层RNA的ng/（中间层RNA的ng数+第一个水相中游离的RNA）。
从1 × 107人类贴壁细胞中获取75%的交联RNA并且超过10 ug的RBPs，而非交联的对照组恢复最少（图6）。人类细胞系中每个OOPS实验可以检测到~1,500个结合蛋白，超过10 ug的RBPs。当利用SILAC进行LC−MS/MS分析，研究者不建议检测SILAC对作为MS2片段的前提。依据这条建议，期盼有三个群体的蛋白：与RNase或者交联阴性对照比没有富集的蛋白、与阴性对照比富集的蛋白(RBPs)以及阴性对照中没有检测到信号的蛋白（高度富集的RBPs）。OOPS是一种高度有效富集RBP的技术，在阴性对照样本中通常检测不到信号。如果与重复组一致，这些蛋白被视为一个RBP。图7a展现了交联+/−和RNase +/−实验中SILAC的比率。
图6 银染说明OOPS的不同阶段（a）OOPS方法应用于非交联（CL-）和交联的（CL+）U2OS细胞中，从以下阶段获得蛋白样品：分离之前的细胞裂解（inputs）、每个经过三轮TRIzol分离后的有机相（有机相1,2,3）以及RNase和最终TRIzol分离后的有机相（有机相4）。样本随着蛋白梯度marker在4-12%的Bis-Tris胶上进行，随后进行银染；（b）阳性的RBP对照的免疫印迹(NCL; Nucleolin, 100KDa, PTB; 60KDa；HuR; 36KDa)以及阴性对照蛋白(H3; Histone-H3; 18KDa、β-tubulin; 55 KDa)。
在OOPS中对整体蛋白丰度和RNA结合蛋白丰度平行定量来对不同条件下RBP组学的动态变化定量时，可以利用线性模型确定RNA结合中发生重要变化的蛋白。对于大多数生物刺激，感兴趣的蛋白将会是那些在整体蛋白丰度上有很小或者没有变化的蛋白，并且在RNA结合丰度具有可重复性的改变。图7b展示了之前报道数据中糖酵解途径蛋白的整体的和RNA结合的丰度。
图7 OOPS MS结果（a）利用U2OS进行SILAC交联(CL) +/− 以及RNase +/−实验的预期结果。在阴性对照样本中并未检测到蛋白信号，与CL或者RNase样本中的伪值等价。这些伪值代表在CL或者RNase条件下高度富集的蛋白。Log的比率接近0代表蛋白没有显著富集，可能是非RNA结合；（b）诺可达唑停滞0 h以及释放6 h和23 h全部和RNA结合蛋白的丰度。蛋白的丰度是每个样本的中位值并且与给定样本中整体蛋白质丰度相对，并且在整体的和RNA结合的定量中可比较。结果显示了糖酵解信号通路的成员。在停滞和释放的时间点观察到RNA结合蛋白的显著升高。
结论
正交有机相分离的方法（OOPS）是一种快速、有效并且可重复的方法能够以无差别的方式将交联的RNA-蛋白加合物进行纯化。OOPS避免了分子标签或者捕获聚腺苷酸RNA。相反，它是在标准的TRIzol分离到RNA-结合蛋白（RBPs）富集之间取样并且它们同源结合RNA。OOPS的特异性是通过RNases消化的富集界面或者蛋白酶释放的RBPs或者蛋白结合RNA分别实现的。在本文中研究者呈现了从同一样本中纯化蛋白-RNA加合物、游离蛋白质以及游离RNA一步步的方法，并且进一步描述了OOPS如何应用到人类细胞、拟南芥、裂殖酵母、大肠肝菌中，以及它如何用来研究RBP的动力学。