科研| ENVIRON POLLUT：酶活性和测序分析与代谢组学相结合对土壤微生物响应多环芳烃胁迫的新认识（国人佳作）
编译：Peragh，编辑：谢衣、江舜尧。
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多环芳烃(PAHs)是分布最广泛的有机污染物之一，对土壤微生物有很强的毒性。长期污染的土壤是否仍能对新输入的污染物做出反应尚不得而知。本研究通过对土壤酶活性、土壤微生物群落结构和功能以及微生物代谢途径系统地研究了土壤微生物对新输入的多环芳烃胁迫的响应。由微生物活性决定的土壤脱氢酶和脲酶活性在微生物暴露于多环芳烃后受到抑制。此外在多环芳烃胁迫下，土壤微生物群落和功能发生了明显的变化。多环芳烃胁迫降低了土壤微生物多样性和丰富度，根瘤杆菌、鞘脂菌、分枝杆菌、马西利亚菌、芽孢杆菌和假节杆菌受多环芳烃胁迫的影响较大，可作为农业土壤多环芳烃污染的重要指标。此外我们预测对多环芳烃胁迫做出反应的大多数微生物的代谢功能都受到了不利影响。最后土壤代谢组学进一步揭示了土壤的一些代谢途径受到了抑制，如脂肪酸、碳水化合物和氨基酸的代谢，所以土壤代谢物组成发生了明显的变化也反映了土壤代谢的变化。综上所述，新输入的污染物进入长期污染的土壤会抑制微生物的活性和代谢活动，这可能会对整个土壤质量产生深远的影响。
论文ID
原名：New insights into the responses of soil microorganisms to polycyclic aromatic hydrocarbon stress by combining enzyme activity and sequencing analysis with metabolomics
译名：酶活性和测序分析与代谢组学相结合对土壤微生物响应多环芳烃胁迫的新认识
期刊：Environmental Pollution
IF：5.954
发表时间：2019.09
通讯作者：宋洋
通讯作者单位：中国科学院南京土壤研究所
实验设计
本研究的目的是系统地描述长期多环芳烃污染土壤中土壤微生物对“新鲜”多环芳烃胁迫的响应。因此，在农业土壤中加入菲、芘和苯并芘三种典型的、备受关注的多环芳烃，以创造一种“新鲜”的多环芳烃胁迫土壤。首先通过测定土壤酶活性来评价与土壤微生物代谢和养分循环密切相关的土壤微生物活性的变化。然后，通过测序和功能预测，研究了土壤微生物群落结构和功能的变化，进一步揭示了土壤微生物生态系统潜在的变化。最后，通过土壤代谢实验进一步证实了新输入的多环芳烃改变了特定的微生物代谢过程。
实验结果
1土壤酶活性对多环芳烃添加的响应
土壤酶是重要的催化剂，酶活性被认为是多环芳烃等外源化合物对土壤生物解毒的指标。脱氢酶是一种与土壤中有机化合物降解有关的常见氧化还原酶，其活性是衡量污染物胁迫对微生物代谢活动的重要参数。如图1A所示，多环芳烃胁迫导致脱氢酶活性显著下降(p<0.05)。在另一项向土壤中引入高剂量多环芳烃的研究中也观察到脱氢酶活性的抑制。多酚氧化酶是土壤微生物在分解芳香物质过程中释放的一种关键酶，在多环芳烃胁迫下，多酚氧化酶活性在统计上没有显著增加(图1B)。此外，脲酶活性是微生物活性的另一个常用指标，特别是用来估计微生物利用土壤氮的能力。脲酶活性在对多环芳烃胁迫的响应中显示出显著的下降(p<0.05)(图1C)，这与另一项研究的发现一致。脱氢酶活性被确定为土壤条件变化最敏感的指标(图1)，这与另一项研究的结果一致。据报道，脱氢酶和脲酶活性的变化表明了整个微生物代谢活动的变化，例如土壤中碳或养分的微生物转化。因此在长期污染的土壤中引入“新鲜”多环芳烃后，土壤微生物的代谢活动可能会发生改变。
图1多环芳烃胁迫对脱氢酶（a）、多酚氧化酶（b）和脲酶（c）活性的影响。CK：对照土，ST:多环芳烃胁迫处理。*和**分别在表示LSD测试比较后，在p<0.05和p<0.01的水平上实验组和对照组之间的显著差异。
2土壤微生物群落结构对多环芳烃添加的响应
微生物是土壤生物地球化学循环中的关键角色，调查微生物群落结构的变化有助于理解和预测土壤生态环境因应污染物而发生的变化。“新鲜”的多环芳烃胁迫导致实验组与对照组中微生物群落结构发生了改变(图2a)，与对照组相比，多环芳烃胁的加入致使361个新的OTUs出现和381个OTUs消失(图2b)。这种变化应归因于环境选择，即一些适应非生物多环芳烃胁迫的微生物类群能够存活并生长，而那些不能适应胁迫的微生物类群则会逐渐消失。此外我们观察到，用Shannon 指数评价微生物多样性的下降在统计上没有显著意义，但用Chao 1指数(图1)评价物种丰度，则显示多环芳烃胁迫导致了微生物丰度显著下降(p<0.05，图2c)。
从门到属，我们观察到的微生物响应群体主要是土壤中的高丰度个体(相对丰度>1%)(图3)。在多环芳烃胁迫(LDA>2.5)下，根瘤杆菌显著富集，而鞘脂菌、分枝杆菌、马西利亚菌、芽孢杆菌和假节杆菌显著减少(图4)。我们发现，当“新鲜”的多环芳烃被引入长期污染的土壤时，能够降解多环芳烃的微生物，如鞘脂菌、分枝杆菌、马西利亚菌和芽孢杆菌受到了抑制，这可能解释了即使土壤中存在潜在的降解菌但土壤中多环芳烃残留量仍然较高的原因。在较高的科水平上，多环芳烃胁迫对β蛋白细菌目的伯克氏菌科、嗜甲基菌科和TRA3_20的生长有显著的促进作用(LDA>2.5)，其中β蛋白细菌可以形成生物膜并在不利环境中生存。作为对比，在科水平上，分枝菌杆科(棒杆菌目)、微球菌科(微球菌科)、诺卡氏菌科(丙酸菌科)和芽孢杆菌科(芽孢杆菌属)的生长受到明显的抑制(LDA>2.5)，而多环芳烃胁迫对杆菌科(棒状菌目)、微球菌科(微球菌目)、诺卡氏菌科(丙酸杆菌目)和芽孢杆菌科(芽孢杆菌目)的生长均有显著的抑制作用(LDA>2.5)。在门的水平上，酸杆菌门、Patescibacteria门和变形菌门对“新鲜”多环芳烃胁迫表现出显著的正响应，而放线菌门、厚壁菌门和绿弯菌门对“新鲜”多环芳烃胁迫表现出显著的负响应(LDA>2.5)(图4)。因此革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更容易受到多环芳烃胁迫的影响，其中大多数是寡营养微生物类群。正如在其他研究中观察到的那样，多环芳烃的输入可能导致多营养细菌而不是寡营养细菌的积极发展。
图2主坐标分析（PCoA）（a）、在OTUs水平上的韦恩图（b）和α多样性指数（c）。
图3对多环芳烃胁迫有显著响应的微生物类群的相对丰度。
图4基于多环芳烃胁迫处理对实验组和对照组土壤中微生物个体相对丰度比较的线性判别分析图。红色圆圈表示处理组土壤中显著丰富的类群，蓝色圆圈表示对照组土壤中显著丰富的类群。只有满足线性判别分析显著性阈值(LDA>2.5)的分类群才会显示出来，并进行颜色编码。支序图的六个环从内到外分别表示域(最里面)、门、纲、目、科和属。
3土壤微生物功能对多环芳烃添加的响应
微生物群落的变化会引起土壤微生物功能的变化，我们用PICRUST对功能基因进行了预测。预测结果表明，多环芳烃胁迫导致功能基因组成发生了较大的变化（图5a）。尤其是139个功能基因在“新鲜”多环芳烃胁迫下消失，而27个新的功能基因被激活（图5b）。所有预测的功能基因主要与KEGG途径中的7个成分相关（图6），其中约52%与代谢相关，16%与遗传信息处理相关，13%与环境信息处理相关。由于大部分功能基因与代谢有关，因此有必要进一步探讨土壤微生物代谢对多环芳烃胁迫的响应。
参与外源物质（如多环芳烃）、氨基酸、碳水化合物和脂类代谢的功能基因，在多环芳烃输入后表现出明显的抑制作用，(p<0.05)(图7a和7b)。多环芳烃作为一种新引入的碳源，导致与12种外源物质相关的生物降解功能基因的表达显著下调(p<0.05)(图7b和图7c)，所以与多环芳烃降解相关的微生物数量的减少可能是多环芳烃生物降解下调的原因(图4)。此外多环芳烃胁迫显著抑制脂质代谢，显著下调酮体的合成和降解，类固醇激素、类固醇、次级胆汁酸、初级胆汁酸和不饱和脂肪酸的生物合成，以及亚油酸、甘油酸、脂肪酸、醚脂和α-亚麻酸的代谢(图7b和图7c)。多环芳烃胁迫还显著抑制了碳水化合物代谢，如淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、半乳糖、果糖和甘露糖、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、N-聚糖和糖鞘脂的生物合成以及柠檬酸循环(TCA循环)，但是却显著促进了脂多糖生物合成蛋白、脂多糖的生物合成和糖基转移酶的合成(图7b和图7c)。据报道，脂多糖和糖基转移酶可能有助于诱导微生物对环境压力的反应。氨基酸是驱动微生物代谢和生物合成的重要初级代谢物，与其相关的代谢功能也受到多环芳烃胁迫的抑制。特别是，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的降解以及色氨酸和β-丙氨酸的代谢受到极大的抑制(图7b和图7c)。以上结果表明，长期污染土壤中“新鲜”多环芳烃的输入仍可能对微生物代谢功能产生负面影响。
图5功能基因的主坐标分析（PCoA）和维恩图（b）显示了它们在多环芳烃胁迫下的变化。ST：多环芳烃胁迫处理土壤和CK：对照土壤。
图6实验组和对照组土壤KEGG通路各功能基因所占比例。
图7多环芳烃胁迫对土壤代谢功能的影响(A)、代谢功能改变的程度(B)，显著改变的功能代谢途径，预计涉及脂肪代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢和外源物质的生物降解和代谢(C)。蓝点表示对照土壤中功基因能的丰度，红点表示多环芳烃胁迫处理土壤功基因能的丰度。
4土壤微生物代谢产物对多环芳烃添加的响应
我们预测功能基因的变化与潜在的微生物过程有关，土壤代谢物组成和含量的变化使我们能够揭示土壤微生物过程对土壤中外源污染物的直接和已经发生的反应。43种代谢物含量对多环芳烃胁迫反应显著(p<0.05)，其中31种代谢物含量增加，12种代谢物含量下降(图8和图9)。这些响应较大的代谢物的组成在实验组土壤中与对照组土壤中有明显的差异(图9)。这些产物的变化主要发生在有机酸、碳水化合物和脂质的代谢中，受多环芳烃胁迫影响最大的是有机酸。此外仅有脂肪、氨基酸和酒精含量对多环芳烃胁迫呈现显著的正响应(图9)。微生物在氨基酸代谢和脂质代谢方面的功能受到抑制，这可能是多环芳烃胁迫后土壤中脂质和氨基酸富集的原因(图7和图8)。
在对多环芳烃胁迫有显著正响应的代谢物中，有机酸、碳水化合物和脂类分别占的26%、10%和26%(图8)。在多环芳烃胁迫下,3-羟基丁酸和2-酮基己二酸两种有机酸的含量最丰富(图10)。污染物可被微生物用作碳源，从而增加氨基酸的生物合成,这也与功能预测一致，即多环芳烃胁迫促进了研究土壤中氨基酸的生物合成，而抑制了氨基酸的降解(图7c)。此外，对于微生物细胞抵抗环境压力非常重要的脂质也得到了极大的富集，这表明了一种微生物抗性机制。此外对多环芳烃胁迫有显著负面反应的代谢物中，分别有42%和25%是有机酸和碳水化合物(图8)。多环芳烃的引入使土壤中对甲氧基苯甲酸的含量显著降低。两种碳水化合物的含量在多环芳烃胁迫下下降幅度最大（图10），因此我们推测作为微生物代谢重要能量来源的单糖或双糖的含量对多环芳烃胁迫有明显的负反应。
代谢物组成的变化共同反映了土壤微生物代谢过程的变化。调节某些代谢途径是土壤微生物群落应对环境压力的主要策略。为了进一步确定实验组和对照组土壤代谢过程的具体变化，我们对响应显著的土壤代谢产物进行了通径富集分析。如图图11所示，在多环芳烃的胁迫下，赖氨酸生物合成和降解是变化最显著的代谢途径(p<0.01)。这也证实了功能预测的结果(图7C)。此外，色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸和脯氨酸等氨基酸的代谢也发生了显著变化(p<0.05)，PICRUST(图7)预测结果显示与这些氨基酸相关的代谢功被抑制。同样，嘌呤代谢、脂肪酸生物合成、丁酸代谢、酮体合成和降解、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢和硫代谢也受到多环芳烃胁迫的显著影响(p<0.05)(图7和图11)。因此，这些特定代谢表型的变化可能归因于土壤微生物代谢功能的改变。
图8响应多环芳烃胁迫的土壤代谢物的火山区，红色气泡表示代谢物显著减少，蓝色气泡表示代谢物显著增加，灰色气泡表示代谢物无统计学差异。饼状图显示了每种土壤代谢物的比例。
图9多环芳烃胁迫对土壤代谢物热图的影响。ST：多环芳烃胁迫处理土壤和CK：对照土壤。
图10多环芳烃（胁迫对土壤碳水化合物、脂肪和有机酸代谢产物的影响。
图11土壤中多环芳烃胁迫对代谢途径影响的气泡图。
5微生物类群、功能基因与代谢产物的关系
为了阐明哪些微生物类群是引起土壤微生物代谢变化的主要原因，我们构建了一个连接响应微生物和差异代谢物的互动网络图。如图12所示，门水平上的变形菌门和Patescibacteria门，纲水平上的嗜热油菌、Parcubacteria菌和γ变形杆菌，目水平上的β变形杆菌，属水平上的分枝杆菌和芽孢杆菌与几种不同的代谢物，包括酵素甾醇、黄烷酮、麦角固醇、安息香、9-荧酮、3-己烯二酸和3-羟基丁酸共出现的频率最高，表明这些微生物可能是差异微生物代谢网络对多环芳烃胁迫反应的关键驱动因素。“新鲜”多环芳烃胁迫使变形杆菌和Patescibacteria的数量上升，同时增加了酵素甾醇、黄烷酮、麦角固醇和3-羟基丁酸的含量，降低了安息香、9-荧酮和3-己烯二酸的含量(图4、12和9)。微生物群落与不同代谢物相关最显著的是β变形杆菌(图12)。有研究表明β蛋白细菌在压力环境中有利于微生物适应，它们对代谢系统的调节可能是一种重要的适应能力。异麦芽糖和蜂蜜二糖含量的显著降低可能主要受酸杆菌门、棒状菌目和丙酸菌目、分枝菌科和诺卡氏菌科以及鞘氨醇属的调控。结果表明，异麦芽糖和蜜二糖的含量显著降低可能与酸杆菌门、棒状杆菌目和丙酸杆菌目、分枝杆菌科和诺卡氏菌科以及鞘脂菌属有关。随着酸杆菌丰度的增加，异麦芽糖和蜜二糖的含量下降(图4、12和9)，伯克氏菌科丰度的增加导致对茴香酸含量的降低。一些代谢物可能是微生物分泌物的成分所以导致它们正向共存，而一些的微生物代谢消耗解释了微生物类群和代谢产物之间的负相关关系。
土壤微生物群落及其代谢之间的关系也可以通过KEGG数据库中基于代谢途径的微生物功能基因和代谢产物的组合来描述。如上所述，与碳水化合物代谢、脂肪酸生物合成和氨基酸代谢相关的微生物代谢过程受到“新鲜”多环芳烃胁迫的显著抑制(图7和11)。因此我们将代谢网络和土壤代谢物与PICRUST预测的相应代谢途径中的功能基因结合起来。该途径网络清楚地展示了微生物功能基因如何调控土壤代谢物的含量，这是一个复杂的协同代谢相互作用。在碳水化合物代谢(图13a)中，蔗糖代谢到D-葡萄糖-6P、蜜二糖和海藻糖的途径受到抑制，因此这些下游代谢物的含量明显下降。多环芳烃胁迫促进了乙酰辅酶A向丙二酰辅酶A的转化，但抑制了随后的脂肪酸代谢。在脂肪酸代谢途径中，功能基因的抑制导致辛酸和癸酸的显著减少(图13b)。三氯乙酸循环是连接三种化合物代谢途径的枢纽。在氨基酸代谢方面(图13c)，虽然多环芳烃胁迫下土壤中许多氨基酸代谢产物的含量显著增加，但进入TCA循环的重要下游代谢途径受到抑制，赖氨酸的生物合成和降解对多环芳烃的胁迫表现出极大的响应(图11)，并且与赖氨酸降解相关的功能基因显著下调(图13a)。代谢途径的功能预测还表明，多环芳烃胁迫主要抑制土壤中氨基酸的降解，但促进某些氨基酸的生物合成(图7C)，导致土壤中某些氨基酸含量增加(图13和9)，所以当土壤暴露于多环芳烃胁迫时，微生物群落中的氨基酸代谢总体上受到抑制。
因此，长期污染土壤中输入的“新鲜”多环芳烃主要抑制了土壤中碳水化合物代谢、脂肪酸生物合成和氨基酸代谢的微生物代谢过程，也使土壤脱氢酶和脲酶活性的显著降低。因此微生物群落对“新鲜”污染物胁迫的长期响应确实存在，并可以通过测序和土壤代谢组学的耦合分析来综合阐明。
图12响应多环芳烃胁迫的不同微生物类群和不同代谢物的网络图。
图13多环芳烃胁迫对碳水化合物(红箱)、脂肪酸(黄箱)和氨基酸(绿箱)代谢网络的影响。红色箭头代表多环芳烃胁迫促进的这些途径中功能基因的丰富性，蓝色箭头代表多环芳烃胁迫抑制的功能基因的丰富性。
结论
在本研究中，我们系统地描述了长时间收到多环芳烃污染土壤中的土壤微生物生态系统对“新鲜”多环芳烃胁迫的响应变化。从土壤酶活性、微生物群落结构与功能、土壤代谢等方面研究发现，多环芳烃胁迫对土壤微生物代谢活性(脱氢酶和脲酶活性)有明显的抑制作用。土壤微生物群落和功能在“新鲜”多环芳烃胁迫下发生了明显的变化。这一点在不同的土壤代谢物组成中表现得很明显，这反映了土壤代谢的变化。此外土壤代谢组学进一步揭示了抑制土壤代谢的特异性过程，包括碳水化合物代谢、脂肪酸代谢和氨基酸代谢。
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.113312