科研| J Hazard Mater：代谢组学和脂质组学研究揭示了多溴联苯醚-47对乳腺癌小鼠的影响（国人佳作））
编译：阿温，编辑：谢衣、江舜尧。
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多溴联苯醚-47 (BDE-47)是多溴联苯醚(PBDEs)的同系物，与很多不同的健康风险有关。然而，关于BDE-47与乳腺癌关系的体内研究很少。在本研究中，我们将BDE-47作用于乳腺癌裸鼠体内，然后进行质谱代谢组学和脂质组学分析来研究小鼠的代谢变化。结果显示，肿瘤大小与BDE-47用药剂量呈正相关。代谢组学和脂质组学分析表明，BDE-47引起肝脏的代谢途径发生显著变化，包括谷胱甘肽代谢、抗坏血酸和醛糖代谢、脂质代谢等。磷脂酰胆碱(PCs)和磷脂酰乙醇胺(PEs)的上调提示膜的重构，而溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)的下调可能与肿瘤的生长有关。靶向代谢组学分析显示，BDE-47抑制脂肪酸的β-氧化(FAO)和诱导FAO不完全。FAO的抑制和PPARγ的下调会导致炎症，进而可能促进肿瘤生长。此外，BDE-47提高细胞因子的表达，包括TNFRSF12A、TNF-α、IL-1β和IL-6，而降低细胞因子SOCS3和核受体PPARα的表达。这些细胞因子和受体的变化可能导致小鼠肿瘤的生长。
论文ID
原名：Metabolomics and lipidomics study unveils the impact of polybrominated diphenyl ether-47 on breast cancer mice
译名：代谢组学和脂质组学研究揭示了多溴联苯醚47对乳腺癌小鼠的影响
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：7.65
发表时间：2020.5.15
通讯作者：蔡宗苇
通讯作者单位：香港浸会大学
实验设计
实验结果
1. 评价BDE-47对乳腺肿瘤生长的影响
我们基于人体组织浓度和先前报道的毒性研究来选择作用浓度。每周监测不同剂量的BDE-47对小鼠乳腺肿瘤体积的影响。肿瘤体积的计算是通过以下方程：肿瘤体积=(长度×宽度2×π)/6。四组小鼠的肿瘤体积随BDE-47作用时间的变化如图1A所示。四组小鼠在BDE-47作用初期的肿瘤体积及实验期间的体重均无明显差异，但随着作用时间的延长，肿瘤逐渐增大。治疗组的肿瘤生长速度高于对照组，说明BDE-47促进了肿瘤的生长。在作用结束时，治疗组和对照组的肿瘤体积有显著差异(图1B)，说明BDE-47的作用与小鼠乳腺癌的发展呈正相关。
2. 代谢组学分析
利用Q-Exactive UHPLC-MS/MS系统对肝脏样品进行代谢组学分析。代谢产物通过MS/MS图谱与HMDB数据库(http://www.hmdb.ca)中的图谱比较得到。鉴定出18个来自正电离模式的代谢产物和12个来自负电离模式的代谢产物(表S1)。小鼠乳腺癌中不同种类的氨基酸、抗坏血酸相关代谢物、谷胱甘肽相关代谢物、脂质和脂肪酸β-氧化中间体等在BDE-47治疗后发生显著变化。代谢产物发生显著变化的通路使用MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca)进行分析。结果显示，甘油磷脂代谢、谷胱甘肽代谢、抗坏血酸和醛糖酸代谢是最受干扰的途径(图2A)。在正向电离模式(图2B)和负向电离模式下鉴定的代谢物的PLS-DA评分图显示BDE-47组有明显的分离，表明BDE-47对小鼠的代谢有明显的剂量依赖性改变。三种最受干扰的代谢途径中，代谢物的浓度变化如图2C。与对照组相比，高剂量BDE-47治疗组中氧化谷胱甘肽(GSSG)和抗坏血酸相关代谢物增加。谷胱甘肽(GSH)和抗坏血酸是有效清除活性氧(ROS)的还原剂，如生物系统中的过氧化氢和羟基自由基。原则上，还原型谷胱甘肽(GSH)为自由基提供一个电子并与另一个谷胱甘肽形成GSSG，抗坏血酸可以为酶促反应和非酶促反应提供电子以减少ROS。考虑到谷胱甘肽和抗坏血酸减少等价物来维持内部氧化还原平衡和保护潜在的氧化应激，BDE-47作用小鼠中氧化状态被提高，说明细胞更容易受到氧化应激的影响，这是一个风险因素，能促进乳腺癌细胞增殖。对于涉及甘油磷脂代谢的代谢物，BDE-47组中溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、甘油磷酸乙醇胺(GPEA)和甘油磷酸胆碱(GPC)与对照组相比有所降低，说明BDE-47对小鼠肝脏的脂质体有干扰作用。低脂与乳腺癌密切相关。因此，在BDE-47组中检测到的LPC、LPE、GPEA和GPC的降低可能与肿瘤细胞的增殖呈正相关。此外，乙酰肉碱能促进乙酰辅酶A运输到线粒体，并在维持线粒体的能量稳态中起着重要作用，结果显示与对照组相比，BDE-47组呈剂量依赖性增加趋势。乙酰肉碱的变化可能提示BDE-47作用后会引起脂肪酸氧化(FAO)的紊乱。
3. 脂质组学的数据分析
脂质体是由细胞、器官或生物体内的所有脂类物质组成。脂质是细胞内的主要物质，具有多种生物功能，包括构建生物膜、调节能量转换、传递细胞信号等。因此，它们参与多种生物过程，如细胞的生长和分化。以往的研究报道脂质与肿瘤的发生和转移有关。因此，研究脂质可能有助于阐明BDE-47对乳腺肿瘤小鼠的影响及其潜在机制。
利用脂质组学方法鉴定了384种脂质，包括磷脂酰胆碱(PC)、三酰甘油(TG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)等。三组BDE-47治疗组的所有脂质都被用于火山图分析(图3B-D)。从图中可以看出，随着BDE-47剂量的增加，脂质变化越明显，说明BDE-47干扰脂质代谢呈剂量依赖性。如图3A中，高剂量治疗组中，脂质明显改变。高剂量组中，13.1%的PCs和PEs水平明显改变。大部分变化的PCs、PEs明显升高，而LPCs、LPEs明显降低。肝脏是脂肪合成和分泌的主要器官。然而，PCs和PEs对功能改变的影响尚不完全清楚。由于PCs和PEs是双分子层的关键成分，所以PCs和PEs的变化可能反映了细胞膜功能的改变，从而影响细胞的增殖能力。脂质组学分析中LPC/LPE的下降趋势与代谢组学分析结果一致。LPC和LPE是脂质形成或降解的中间产物(图5)。以往研究报告显示，在癌症、埃博拉病毒病、败血症和登革热感染患者中，LPC水平较低，提示LPC与不良健康密切相关。因此，BDE-47作用后导致LPCs减少，进而可能影响小鼠肿瘤的发展。
脂肪酸是含有脂肪酰基的甘油磷脂、糖脂磷脂和鞘脂磷脂等的底物和产物。PCs、PEs、LPCs等的改变可能反映脂肪酸代谢的失调。FAO是线粒体中脂肪酸的分解代谢过程，可以为细胞提供能量。在FAO中，脂肪酸首先被CPT1酶转化为酰基肉碱，然后进入线粒体。进入线粒体后，酰基肉碱被CPT2酶转化为酰基辅酶A，然后进行后续分解。由于酰基肉碱和酰基辅酶A在FAO中是重要的中间体，所以对酰基肉碱和酰基辅酶A进行了靶向代谢组学分析。采用高效液相色谱-高分辨率质谱(UHPLC-MS)联用技术进行靶向代谢组学研究。结果显示，与对照组相比，BDE-47组中大多数酰基肉碱增加，而酰基辅酶A减少(图4A-B)。酰基肉碱的积累和酰基辅酶A的减少可能表明肝细胞线粒体中FAO不完全。ROC曲线分析如图4C所示，曲线下面积(AUC)随BDE-47剂量的增加而增大，并且中、高剂量组的AUC均大于0.9，说明乙酰肉碱在肝脏内的积累与BDE-47作用于小鼠体内的剂量呈正相关。
通过监测涉及FAO的关键酶的基因表达，证实了BDE-47可以导致酰基肉碱的增加。q-PCR结果表明，乙酰辅酶A羧化酶(ACACB)的基因表达上调，而肉碱棕榈酰转移酶1A (CPT1A)、肉碱棕榈酰转移酶2 (CPT2)、中链乙酰辅酶A脱氢酶(ACADM)和长链乙酰辅酶A脱氢酶(ACADL)均下调(图4)。ACACB酶催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A，参与FAO的调控。ACACB的上调抑制了CPT1A。CPT1A是FAO的限速酶，调节摄取脂肪酸进入线粒体。因此， BDE-47组中CPT1A的下调表明BDE-47小鼠抑制FAO。CPT2是线粒体中的一种酶，催化酰基肉碱生成酰基辅酶A，是FAO的直接底物。此外，ACADM和ACADL是两个酰基辅酶A脱氢酶，催化酰基辅酶A生成烯酰辅酶A，这是FAO的第一步。因此，在FAO过程中ACACB的上调和CPT1A、CPT2、ACADL和ACADM的下调，表明BDE-47在乳腺癌小鼠中诱导FAO不完全，这可以很好地解释FAO代谢中间产物(酰基肉碱、酰基辅酶A)的变化。
5. BDE-47作用对细胞因子的影响
乳腺炎症的增加与乳腺癌的发展密切相关。采用q-PCR检测炎性细胞因子的基因表达，包括TNF-α、IL-1β和IL-6。结果表明，BDE-47组中TNF-α、IL-1β和IL-6的基因水平明显上调，表明炎症增加，这可能导致乳腺肿瘤生长(图4)。抑制细胞因子信号转导因子3 (SOCS3)可以抑制乳腺癌细胞的增殖。因此，BDE-47组中SOCS3水平的降低有利于肿瘤的生长(图4)。肿瘤坏死因子受体超家族成员12A (TNFRSF12A)是一种调节乳腺癌细胞侵袭的细胞因子。BDE-47组中TNFRSF12A的上调可能促进肿瘤的发展。过氧化物酶体增殖剂激活受体α (PPARα)是一个转录因子，是脂肪酸分解代谢的主要调节因子，也被认为可以抑制乳腺癌的发展。PPARα直接调节Cpt1和Cpt2的表达。因此，PPARα的下调可能减少脂肪酸运输和线粒体FAO，这与以前的研究结果相一致，BDE-47引起酰基肉碱增加和乙酰辅酶A减少。过氧化物酶体增殖剂激活受体γ (PPARγ)负调节炎症。因此，炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的上调可能是由于PPARγ的下调引起(图4)。
6. BDE-47对通路的影响
代谢途径和潜在机制的变化如图5所示。代谢组学和脂质组学分析结果表明，BDE-47明显改变乳腺癌裸鼠的代谢。谷胱甘肽代谢、抗坏血酸和醛酸代谢均明显受到干扰，表明肝脏氧化应激水平升高。代谢组学研究显示，脂质代谢也发生了显著改变，脂质组学研究进一步证实了这一点。大部分PCs和PEs水平发生改变，提示肝脏内磷脂重构。此外，大部分检测到的LPC/LPE均有所下降，这可能有助于小鼠肿瘤的生长。酰基肉碱的增加和酰基辅酶A的减少表明BDE-47对FAO的抑制作用，而BDE-47对CPT1A、PPARα和FAO相关酶(CPT2、ACADM、ACADL和ACACB)的下调需要进一步证实。炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的升高表明炎症增加，这可能是由于肝细胞中FAO的抑制和PPARγ的下调引起。由此产生的炎症进一步促进了小鼠肿瘤的生长。此外，一些与肿瘤生长有关的细胞因子，也可以被BDE-47改变，且呈剂量依赖型。细胞因子TNFRSF12A的上调可以促进肿瘤生长，细胞因子SOCS3和PPARα的下调可以抑制肿瘤的生长，这可能有利于肿瘤细胞的增殖。
讨论
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2019.121451