科研│J AGR FOOD CHEM：全基因组miRNA分析揭示茶树不同组织中重要风味物质次生代谢与miRNA的关系（国人佳作）
编译：伊一，编辑：景行、江舜尧。
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本研究通过分析相关代谢产物、小RNA(sRNAs)、降解物和共表达网络，研究了九种不同茶树组织中重要风味物质与小RNA(miRNA)的调控关系。共获得272个差异表达的miRNA，包括198个保守的miRNA和74个新的miRNA。同时，通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)研究了miR159-GAMYB、miR167-ARF和miR396-GRF对的表达模式，并通过5′RNA连接酶介导的RACE(5′RLM-RACE)验证了靶点。进一步的共表达分析表明，没食子儿茶素的含量与miR156的表达呈显著负相关，但与miR166和miR172的表达呈正相关。此外，miR169a、miR169l和miR319h的表达与非糖化儿茶素的含量以及ANRa、ANRb和LARb的分泌水平呈正相关。此外，重要的挥发性化合物，如芳樟醇、香叶醇和2-苯乙醇，被发现与miR171o、miRN71a、miRN71b、miRN71c和miRN71d的表达高度正相关。本研究数据表明，这些miRNA可能在调节茶树不同组织中风味化合物的生物合成中起重要作用。
论文ID
原名：Relationship between Secondary Metabolism and miRNA for Important Flavor Compounds in Different Tissues of Tea Plant (Camellia sinensis) As Revealed by Genome-Wide miRNA Analysis
译名：全基因组miRNA分析揭示茶树不同组织中重要风味物质次生代谢与miRNA的关系
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：4.192
发表时间：2021年2月
通讯作者：郭飞
通讯作者单位：华中农业大学园艺林学学院茶学系
DOI号：10.1021/acs.jafc.0c07440
实验设计
结果
1 不同茶叶组织中儿茶素、咖啡因和茶氨酸含量的变化
为了鉴别茶树不同组织—芽（B）、第一叶（FL）、第三叶（TL）、嫩茎（TS）、成熟叶（ML）、老叶（OL）、侧根（LR）、花（F）和种子（S）（图1）中的主要风味物质，研究者检测了儿茶素、咖啡因和茶氨酸的含量。高效液相色谱分析结果表明，儿茶素、咖啡因和茶氨酸在九种不同组织中的含量差异显著(图2)。总儿茶素在第三片叶子中积累到最高水平，没食子儿茶素型儿茶素(ECG和EGCG)是主要的儿茶素，在除侧根之外的8个组织中占总儿茶素的64-97%(分别在嫩茎和种子中最低和最高水平)，侧根仅检测到两种简单的儿茶素，儿茶素(C)和表儿茶素(EC)(图2A)。同时，咖啡因在幼芽中含量最高，随叶片老化而降低，在花中含量较少，但在侧根和种子中未检测到咖啡因(图2B)。L-茶氨酸含量在9个组织中表现出明显的差异(图2C)，并且在B、FL、TL、TS、F和LR中显著高于其他3个组织，其中LR中的含量最高(20.99毫克/克)，比种子中的含量(2.70毫克/克)高近8倍。
图2.不同组织中主要风味化合物水平的变化。(A)儿茶素，(B)咖啡因和(C)茶氨酸。误差线表示三次重复的标准偏差。条形上方的不同字母表示Fisher最小显著性差异，指定的不同表达水平(P < 0.05)。缩写“nd”表示在该组织中没有检测到这种物质。所示数据为平均标准差(n = 3)。
2 不同茶组织中挥发性化合物的变化
用气相色谱-质谱法测定了茶树9种不同组织中挥发性化合物的特征。新鲜组织中的挥发性化合物主要包括萜烯(香叶醇、芳樟醇、反式芳樟醇氧化物)、苯丙烷(苯甲醇、1-苯乙醇(1PE)、2苯基乙醇(2PE)、苯乙酮和水杨酸甲酯(图3和表S2)。有趣的是，这些化合物在9个组织中显示出基本相同的变化模式。例如，除了苯乙酮和苯甲醇，其他化合物在第一片叶子中的含量最高，其次是花或成熟叶子和老叶子。但9种组织中挥发性成分的组成和比例差异较大。总的来说，9种组织中挥发性成分的数量和含量在第一片叶中最多，其次是花、芽、成熟叶和老叶，而侧根和种子不含上述挥发性成分。具体来说，第一片叶中香叶醇、芳樟醇和2-苯乙醇的含量比芽高6倍以上，这是茶叶中的重要香气物质。此外，发现一些挥发物是组织特异性的，即1-苯乙醇和苯乙酮仅在花中发现。
图4.不同组织间miRNA的表达模式。不同组织中miRNA的热图。颜色梯度说明了miRNA表达值的Z分数。
3 小RNA测序图谱
用小RNA(sRNA)测序法研究了9种不同茶树组织中miRNA的作用。过滤sRNA测序数据后，获得了大量有效序列(长度为18-25bp)(图S1和表S3)。如表S3所示，每个样品的有效测序读数的平均数量为4.5 M，并且在九个组织中独特的有效sRNA的长度分布中可以观察到类似的模式，其中24nt的RNA是最丰富的sRNA(图S1A)。
为了进一步鉴定已知的miRNA和新的miRNA，研究者将有效的序列与茶基因组(舒茶早)和miRBase 21.0中已知的miRNA进行比对。根据同源性，定位于miRBase的序列被鉴定为已知的miRNA，而定位于茶基因组的序列仅被鉴定为新的miRNA。在这项研究中，总共鉴定了298个成熟的miRNA，包括209个已知的miRNA和89个新的miRNA，其中24-nt的RNA是最丰富的miRNA(图S1B)。其中，102个在所有9个组织中表达，包括81个已知的miRNA和21个新的miRNA(图S2)。成熟微小RNA的长度分布分析表明，21-nt RNA是9种组织中最丰富的miRNA(图S1B)。
4 miRNA在不同茶叶组织中的差异表达
利用R (3.6.3)的Pheatmap (1.0.12)进行差异表达分析，进一步鉴定了9种茶树组织中的组织特异性miRNA。在总共272个成熟的miRNA(198个已知的miRNA和74个新的miRNA)中鉴定出差异表达模式，这些miRNA可以根据它们在9个组织中的表达特征分成10组(第1-10组)。在9个组织中表达的miRNA的数量各不相同，最高的在花中(113个，占总miRNA的41.5%)，最低的在芽和侧根中(均占总miRNA的5个，1.8%) (图4和表S4)。第1、2和4组占茶树特异性miRNA的比例最大，分别达到60%、55.88%和61.54%。对于保守的miRNA，大多数相同的家庭成员聚集在一个群体中。例如，miR390和miR396家族的所有成员都聚集在第8组，这两个家族分别有5个和6个成员。miR8786和miR394家族的成员集中在第5组和第2组，每组分别有35和5名成员。成员数最多(12个)的miR395家族主要分布在4组和8组，每组分别有4个和8个成员。
图5.验证miRNA和它们的靶之间的相互作用。(A)通过小RNA测序和定量逆转录聚合酶链反应对靶基因进行定量表达分析。(B) 5’RLM-RACE降解分析中靶切割位点的验证。
5 通过降解组测序对已知和新miRNA的靶预测
这些miRNA的潜在功能是利用降解组测序技术来确定它们的靶基因。降解组测序得到35065665个原始读数，呈现9875364个独特读数。经过一系列的数据过滤和比对，21363 848个(占35065665个原始读数的60.93%)干净读数成功映射到茶树基因组上有45765个转录本(占55366个转录本的82.66%)。
从混合降解组中共鉴定出516个miRNA靶对，包括191个miRNA的382个靶(112个保守miRNA和79个新miRNA)。根据靶位点标签的相对丰度，所有潜在切割的靶转录本被分为五类。在第0、1、2、3和4类中分别有81、1、173、174和87个靶(图S3)。大多数miRNA(172个)可能只切割几个转录目标(少于5个)，19个miRNA可能切割5个或更多不同的转录目标，83个微小miRNA被检测到只切割一个转录目标。总共有36个靶被鉴定为被miR156d切割，并且这些靶关系中的一些被5’RLM-RACE和qRT-PCR实验验证。定量聚合酶链反应结果与高通量测序结果基本一致(图5)。其中，miR167-ARF和miR396-GRF表达模式相似，其目的基因表达水平较低，但相应的miRNAs在花中表达水平最高。有趣的是，miR159-GAMYB在花中的表达并不呈负相关，而是呈正相关，如sRNA和miRNA在花中的表达。
6 与风味化合物相关的MiRNA共表达网络
利用R (3.6.3)的WGCNA对sRNA数据进行分析，综合研究了miRNAs在调控不同茶叶组织中主要风味物质和挥发性物质生物合成中的作用。WGCNA鉴定了12个不同的共表达模块，包含308个miRNAs(用12种不同的颜色标记)，模块大小从4个miRNAs(绿黄色模块)到118个miRNAs(绿松石模块)(图6)。基于P值的模块和化合物之间的相关性如图6所示。如蓝绿色模块与苯乙酮和1-苯乙醇的相关性分别都达到1，说明该模块中的miRNAs可能参与了花中这两种化合物的调控；灰色模块与没食子儿茶素有很高的相关性(~0.90)，表明这些miRNAs最有可能参与茶树中没食子儿茶素的生物合成。
7 miRNA表达谱与风味物质的相关性分析
通过结合miRNAs、高效液相色谱和气相色谱-质谱的数据，并获得40个miRNAs和13个风味化合物具有显著相关性(cor ≥ 0.7或cor≤0.7)，确定与主要风味化合物具有最大潜在关系的miRNAs(图7)。miRNAs的表达与儿茶素和挥发性化合物有很强的相关性。例如，没食子儿茶素的含量与miR156a、miR156c和miR156q的表达显著负相关，但与miR166j、miR172b和172d的表达正相关。非尿苷儿茶素的含量与miR169、miR171和miR319家族的表达呈正相关。此外，鲜茶叶中的重要香气物质如芳樟醇、香叶醇和2-苯乙醇与miR171o、miRN71a、miRN71b、miRN71c和miRN71d的表达呈高度正相关。
图7.miRNA与主要口味的相关系数。
讨论
本研究以茶树不同组织的特征——代谢产物和挥发性化合物为重点，研究了茶树中miRNAs及其靶标的鉴定、分类、差异表达、靶标的确定和功能相关性。
1 茶树不同组织中风味物质的含量不同
在本研究中，茶树发育过程中，不同组织中茶叶的风味物质差异很大。一般来说，像儿茶素和咖啡因这样的化合物主要集中在新的旺盛生长的嫩枝中，在成熟组织中含量较少。具体来说，侧根显示出非常低的儿茶素含量，仅检测到非糖化儿茶素(C和EC)，这与先前的研究结果一致。然而，侧根的茶氨酸含量远远高于其他组织(图2C)，这在多种茶树品种中是一致的。
在茶叶中，挥发性化合物是影响其产品质量的重要成分，如红茶和乌龙茶。在这些产品的制造过程中或在生物和非生物因素的影响下，挥发性化合物的形成和改性已得到广泛研究。然而，对不同组织中挥发性化合物的关注较少。一般来说，新鲜茶叶含有较少的香气成分，大部分是在制茶过程中产生的。以往的研究根据不同的生物合成途径将新鲜茶叶中的香气成分分为挥发性脂肪酸衍生物、挥发性萜烯和挥发性苯丙素/苯烯类化合物，这三类挥发性物质导致了茶叶不同的气味特征。在本研究中，在茶产品的主要原料芽、第一叶、成熟叶和老叶中检测到更多的挥发性成分。其中，花蕾和第一片叶子含有较多的芳樟醇、香叶醇和苯乙醇，有花香；检测到成熟叶和老叶含有更多苯甲醇，这显示出水果味。
以往的研究表明，1-苯乙醇(1PE)是茶树花中的主要芳香物质，但在茶叶中很少发现，这一发现得到了本研究的支持。同时，在花中检测到大量苯乙酮，1PE的前体。由于本研究者收集的花刚刚展开，这些苯乙酮可以推测在花发育过程中转化为1PE。同时，1PE在当归短链脱氢酶/还原酶(CsSDR)的催化下，可以形成苯乙酮。与1PE不同，2-苯乙醇(2PE)在第一片叶中含量最高。尽管它们都来源于L-苯丙氨酸，但是叶和花中2PE、苯甲醇和1PE的不同积累取决于底物的可利用性。
2 miRNA在不同的茶叶组织中有不同的功能
在以前的研究中，已经发现 miRNA参与植物不同组织的各种生长和发育过程。在叶片发育过程中，miRNA166通过hd-zipIII家族成员卷叶1 (rld1)调节玉米叶片的极性。在茶树中，miR166a-3p被认为参与了茎外植体脱分化和再分化的调控。在本研究的数据中，miR166c、miR166h和miR166j在芽中的表达水平高于侧根，侧根可能具有与先前报道的miR166a-3p相同的功能。在与茶树品种“平阳特早茶”芽发育相关的 miRNA的研究中，发现了21个相关的 miRNA。在另一项研究中，Csn-miR319c及其靶基因CsnTCP2 tea被证实与顶芽萌发有关。在本研究中，发现miR319家族在幼芽中的表达低于其他生长旺盛的组织(嫩茎和花)，表明miR319可能与茶芽的发育有关。
到目前为止，与叶的研究相比，除了杜鹃红山茶的一项研究外，对茶树花器官miRNA的研究非常有限。miRNA319、miRNA160和miRNA167在幼叶和心皮中都有高表达，但在其他组织中表达较低，这与本研究的数据一致，表明这些miRNA在山茶属物种中保留了它们的功能。
通过下调一组AP2域转录因子来加速开花，miR172也被证明在花的发育中起着重要的作用，这与本研究发现的MiR172家族成员在花中特异表达是一致的。在本研究中，在幼叶(RPTM = 129-199)中观察到一定量的miR172b和miR172d表达，但在侧根或果实中没有；同时，miR172a、miR172c和miR172e仅在花中表达，miR172c和miR172e高表达(RPTM = 5422)，表明后两者与茶树花器官的形成密切相关。MiR167也是进化上保守的miRNAs之一，与其靶基因ARF一起调节开花时间和果实发育。本研究数据还表明，这个miRNA家族在花和果实中高度表达。有趣的是，miR167e在花中几乎特异表达，花中miR167f的表达比种子中高约76倍，在该家族的其他成员中没有显著差异，推测这两个成员可能在花的发育中起重要作用。
还对参与种子发育的miRNA进行了一些研究。在水稻中，发现miR156及其目的基因理想植株结构1 (IPA1)与其种子的休眠有关。在本研究测序数据中，miR156b、miR156d和miR156e在种子中相对于其他八种组织高度表达，这意味着它们与茶树的种子发育有关。此外，在本研究中，miR156家族的其他四个成员在侧根中高度表达，这与在拟南芥中发现的结果相似。由于植物生长发育是一个复杂的网络，miRNA不仅与特定的组织发育有关，而且在植物发育阶段的转化中起着重要作用。研究表明，miR156、miR159、miR166、miR172和miR396与植物发育阶段的转化有关。在本研究结果中，miR166j、miR172b和miR172d的表达随着叶片的成熟而增加，随着植物的成熟而减少，这在miR156、miR159和miR396家族中没有发现。在植物中，miR396GRF基因网络是影响植物生长的重要模块，据报道，它在叶角、茎伸长、花器官生长和病原体抗性中起着重要的调节作用。在本研究中，miR396在花中的表达水平远高于其他组织，miR396a、miR396c、miR396e和miR396h在花中的表达是在芽中的80倍，miR396b和miR396d在花中的表达是在种子中的40倍。这大概和挑料的时间有关。秋天，茶树的叶子生长不旺盛，而花朵却盛开。除了一些保守的miRNA，研究者还发现了大量的特殊miRNA。具体来说，miR8786在成熟和老叶中特异表达。在miRBase数据库中，研究者只发现gra-miR8786a和gra-miR8786b(陆地棉)可能与本研究miR8786属于同一个miRNA家族，但本研究只获得了茎环序列和成熟序列，没有任何功能注释和实验分析，因此miR8786的功能尚不清楚，需要在进一步的研究中进行阐明。
3 参与茶树风味物质生物合成的miRNA及其靶点
在以往的研究中，已经发现许多miRNA通过调节靶基因参与茶树主要风味物质的生物合成，这些靶基因大多是转录因子。其中，miR156-SBP、miR156F3H、miR166-HD-ZIP、miR160/167-ARF、miR393-bHLH、miR396-GRF和miR529-CHI可能参与茶树儿茶素生物合成的调控。先前和当前的研究表明，非糖化儿茶素的含量与CsANR、CsDFR和CsLAR的表达水平呈正相关。根据qRT-PCR和相关性分析，研究者发现CsANRa、CsANRb和CsLARb与miR169a、miR169l和miR319h有很高的相关性。其中9个组织中未检测到miR171d和miR171p。这意味着miR169a、miR169l和miR319h可能通过调节与CsANRa、CsANRb和CsLARb相关的一些靶基因来影响非糖化儿茶素的生物合成(图S4和表S7)。关于没食子酰化儿茶素，先前的研究已经指出，在茶树中没食子酰化儿茶素的生物合成中，氯化石蜡起着重要的作用。结果表明，大多数儿茶素单体的表达与至少一种没食子酰化儿茶素相关。因此，miR166和miR172可能负调控一些影响CsSCPLs表达的靶基因，从而影响没食子儿茶素的生物合成。此外，miR156-F3H和miR828/858-MYB对已被证明在其他植物中调节类黄酮生物合成，但在本研究中未被鉴定。此外，在其他研究中报道的参与茶氨酸合成调节的miR319-MYB对在本研究中并不高度相关。此外，在本研究中，表明miRN58和miRN101与咖啡因含量高度相关，相关系数分别为0.8631和0.9049。在未来的研究中，研究者将重点关注这些miRNA靶标的功能。
先前的一些研究已经研究了参与茶挥发性化合物形成的酶和基因，例如参与芳香化合物形成的β-葡萄糖苷酶；芳樟醇和橙花叔醇形成的碳源物质。但目前仅证实ERF71激活甜橙果实中参与(E)-香叶醇合成的萜合酶基因，对茶香气相关转录因子或miRNAs的研究未见报道。在本研究结果中，发现miR171o和miRN71家族的四个成员可能参与了茶树中重要挥发性化合物的合成调节(相关系数> 0.8)(表S6)。将进行进一步的研究来验证这些miRNA靶对在茶树中的调节功能。
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