科研 | Cell：靶向位于线粒体的circRNA SCAR通过减少mROS输出缓解NASH（国人佳作）
编译：阿温，编辑：景行、江舜尧。
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论文ID
原名：Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output
译名：以线粒体定位的circRNA SCAR为靶点，通过减少mROS输出而缓解NASH
期刊：Cell
IF：38.637
发表时间：2020年9月
通讯作者：苏士成、高志良、许小丁
通讯作者单位：中山大学
DOI号：10.1016/j.cell.2020.08.009
实验设计
结果
成纤维细胞介导多种疾病的纤维化。其中，NAFLD影响了全球25%的人口。为了研究NAFLD患者成纤维细胞的线粒体代谢，本研究从NASH肝硬化和非NAFLD患者的肝组织中分离出成纤维细胞。利用海马细胞外通量分析仪，研究观察到与正常成纤维细胞相比，NASH成纤维细胞中细胞外酸化速率(ECAR)和耗氧率(OCR)增加(图1A)。然而，NASH成纤维细胞中ECAR/OCR比值显著升高(图1B)。同样，棕榈酸盐处理的正常成纤维细胞的ECAR/OCR比值也明显增加(图1C)，这概述了体外脂质暴露。另外，棕榈酸盐处理略微增加了成纤维细胞的凋亡(图S1A)。总之，这些数据表明，在脂质负担下，成纤维细胞中ATP的产生从线粒体氧化磷酸化转变为糖酵解。
电子传递链的质子泵产生的线粒体膜电位(ΔΨm)是产生ATP所必需的。因此，研究JC-1荧光评估了ΔΨm，发现NASH成纤维细胞的ΔΨm明显降低(图1D和1E)。电镜显示ΔΨm降低后伴有线粒体肿胀(图1F)，提示线粒体应激。ROS经常在线粒体应激中增加。因此，研究采用两种方法，包括荧光染料Mito-SOX和DCFH-DA，评估了线粒体中ROS(mROS)和细胞质ROS(cROS)，以及分别用室间特异性ROS传感器mitoORP和cytoORP进行转导。抑制ΔΨm同时，NASH成纤维细胞中mROS和cROS均显著增加(图1G-1J)。同样，棕榈酸盐暴露显著增加了mROS和cROS水平(图S1B和S1C)。mROS可通过线粒体通透性转换孔(mPTP)释放到细胞质中，这是cROS的重要来源。同样，mPTP抑制剂(环孢素A)显著降低了棕榈酸钠处理的NASH成纤维细胞和正常成纤维细胞的cROS水平(图S1D和S1E)。这些数据表明，脂质暴露的成纤维细胞表现出线粒体应激，mROS产生升高，并向细胞质中外泄。
虽然ROS对多种免疫细胞的最佳活化是必需的，但ROS是否介导成纤维细胞激活仍不清楚。为了解决这个问题，研究用ROS抑制剂治疗原发性NASH成纤维细胞，观察到逆转了收缩性(图1K)、胶原合成和α-SMA的表达(图1L)。此外，抑制ROS抑制了炎症细胞因子的分泌(图1M)。同样，抑制ROS消除了棕榈酸盐处理成纤维细胞的促纤维化和促炎症的功能(图S1F和S1G)。总的来说，这些结果表明脂质积累增加了mROS的输出，从而促进成纤维细胞的活化。
图1 脂质暴露的成纤维细胞的促炎性表型一定需要mROS。
环状RNA(circRNAs)是多种细胞类型的关键信号调节因子。然而，circRNA在成纤维细胞中的作用尚不清楚。因此，研究比较了4例NASH肝硬化患者和4例非NAFLD患者分离的原代成纤维细胞的circRNA表达谱。15个和11个circRNA在NASH成纤维细胞中分别持续上调和下调(图2A和S2A-S2C)。引人注目的是，尽管核circRNA在整个circRNomics中占大多数(图S2D)，但很大一部分(11个circRNA中有4个)下调的circRNA是由线粒体基因组编码的(图2B)。其中，NASH患者中3个线粒体circRNA(mito-circRNAs)的抑制通过qRT-PCR在另一个由18例NASH肝硬化患者和20例非NAFLD患者组成的队列中得到验证(图2C)。分离实验表明，这些circRNA主要定位于线粒体而不是细胞质中(图2D)。扩增PCR和测序分析表明，这3个mito-circRNA都是由线粒体基因组通过“反向拼接”机制生成的(图S2E)。尽管hsa_circ_0089763外显子之间保留有一个内含子，但成熟转录本均含有外显子序列。其中，hsa_circ_0089762和hsa_circ_0089763由mito-DNA的轻链产生，hsa_circ_0008882由重链产生(图2E)。
为了研究这些mito-circRNA，研究构建了线粒体靶向纳米颗粒(mito-NP)。mito-NP含有一种核内体PH响应聚合物，可以在核内体酸性微环境下被质子化，从而在细胞摄取后从核内体释放复合物。此外，它由包裹的circRNA表达载体和三苯膦(TPP)修饰的两亲性阳离子肽(TACP)组成，它们专门将包裹的载体传递到线粒体(图2F)。采用动态光散射法测定mito-NP的大小和zeta电位，通过标记封装在mito-NP中的载体检测circRNA表达载体的包封率(EE%)为90.86%±3.24% (Table S1)。免疫荧光显微镜显示，当表达GFP的载体与lipo3000转染成纤维细胞时，只有12.35%±2.35%的GFP信号与线粒体共定位(图2G、2H和S2F)。相比之下，用mito-NP孵育成纤维细胞时，GFP信号与线粒体共定位90.84%±2.22%(图2G、2H和S2F)，说明mito-NP靶向线粒体的特异能力。
使用这个线粒体靶向的纳米颗粒，研究观察到过表达hsa_circ_0089762(脂肪性肝炎相关的circRNA ATP5B调节因子[SCAR])而不是hsa_circ_0008882显著降低NASH成纤维细胞内的cROS(图2I和S2G)。构建一个线粒体特异性表达载体是当前线粒体靶向技术的一个常见障碍。因此，研究不能构建hsa_circ_0089763 mito-NP。总之，这些数据表明抑制mito-circRNA可能在NASH成纤维细胞的激活中发挥作用。
图2 脂质暴露诱发成纤维细胞中线粒体circRNomics的不平衡。
接下来，研究进一步探讨了circRNA SCAR在成纤维细胞活化中的作用。使用特定探针检测circBase中SCAR的圆形转录本，而不是已知的线性转录本(图3A)，RNA荧光原位杂交(FISH)和免疫荧光共染色显示，90.38%±2.56%的内源性circRNA SCAR信号在线粒体内共定位(图3B)。研究分别使用检测SCAR圆形和线性转录本的引物(图3C)，进行了绝对qRT-PCR。研究的数据显示，circRNA SCAR为966.37±114.68拷贝/每个正常成纤维细胞，明显高于其线性版本(443.27±43.69) (图3D和S3A)。NASH成纤维细胞中圆形和线性的SCAR显著减少(图3D)。在NASH成纤维细胞中，圆形SCAR和线性SCAR的比例进一步增加(图S3B)。研究通过RNase R酶切分析证实circRNA SCAR为circRNA(图3D)。
circRNA SCAR起源于其宿主基因(JA760602)的第二个外显子(图2E)。研究将外显子2插入到circRNA过表达载体中(图3C)，并将其封装在mito-NP中。circRNA SCAR的mito-NP显著增加了circRNA SCAR(图3E)，但对未剪接的前体或线性转录本无明显影响(图S3C)。抗RNase R的线粒体片段中的circRNA SCAR水平远高于细胞质片段中的(图3E)。此外，Northern blot分析表明，circRNA SCAR的mito-NP治疗显著增加抗RNase R的circRNA SCAR。相反，其对RNase R敏感的线性转录本保持不变(图3)。此外，该载体RNA产物的测序结果与内源性circRNA SCAR完全吻合(图S3D)。
在功能上，线粒体特异性的circRNA SCAR过表达显著降低了mROS和cROS水平(图S3E)，逆转了NASH成纤维细胞中ΔΨm的抑制(图3G)，研究发现对ECAR/OCR比率没有明显影响(图S3F)。这些数据表明，circRNA SCAR在线粒体中抑制ROS的产生和ΔΨm的降低。
考虑到脂质负担导致mROS积累，研究想知道circRNA SCAR是否可以通过脂质治疗来调节。事实上，研究观察到棕榈酸盐显著降低了circRNA SCAR的表达(图3H)。更重要的是，circRNA SCAR的mito-NP的培养消除了mROS和cROS的升高(图3I)和ΔΨm的降低(图3J)，表明脂质抑制的circRNA SCAR调节了线粒体中ROS的释放和ΔΨm。
在棕榈酸盐处理的成纤维细胞中敲低circRNA SCAR进一步增加了mROS，降低了ΔΨm (图S3G-S3I)，这与过表达实验结果相一致。然而，沉默circRNA SCAR对正常成纤维细胞无明显影响(图S3G、S3J、S3K)，暗示单纯抑制circRNA SCAR对正常成纤维细胞ROS或ΔΨm无显著影响。
接下来，研究者研究了circRNA SCAR是否也调节成纤维细胞的促纤维化功能。circRNA SCAR过表达显著降低了NASH成纤维细胞中胶原和α-SMA的表达(图3K)、胶原收缩(图3L)和细胞因子分泌(图3M)。同样，circRNA SCAR过表达也抑制棕榈酸盐处理成纤维细胞的活化(图S3L和S3M)。此外，在棕榈酸盐处理的成纤维细胞中沉默circRNA SCAR进一步增强了其纤维化前的表型(图S3N和S3O)。总之，这些数据表明，脂质负荷抑制mito-circRNA SCAR，从而抑制ROS的升高和成纤维细胞的激活。
接下来，研究者研究了circRNA SCAR形成的机制。虽然circRNA SCAR预测了一个潜在的开放阅读框(ORF)，但研究在其终止密码子上游插入了一个33 FLAG-coding序列，在潜在的ORF序列中未检测到标记蛋白(图S4A)，表明circRNA SCAR可能是非编码RNA。此外，研究确定了circRNA SCAR中几种microRNA的假定结合位点(图S4B)。然而，这些microRNA都没有超过两个结合位点的，也没有被线粒体基因组转录，这表明circRNA SCAR并不是microRNA的基底。此外，研究没有观察到过表达circRNA SCAR导致其宿主基因(JA760602)发生明显变化(图S3C)，排除了调控JA760602转录本的机制。
RNA结合蛋白在circRNA功能中起关键作用。使用RNA下拉实验和质谱分析，研究鉴定了8个被circRNA SCAR特异性生物素化探针下拉的蛋白(图S4C)。其中检测到作为ATP5A和ATP5B调控因子的mPTP脱颖而出(图4A)，western blotting进一步验证了这一点(图4B)。反之，RNA免疫沉淀(RIP)显示circRNA SCAR由ATP5A或ATP5B特异性沉淀(图4C)。由于ATP5A与ATP5B结合，那circRNA SCAR是否直接与ATP5A或/和ATP5B结合。为了解决这个问题，研究采用体外RNA/蛋白相互作用试验，发现circRNA SCAR直接拉下了重组ATP5B，而不是ATP5A。此外，circRNA SCAR只能在ATP5B存在的情况下检索ATP5A(图4D)。同样，敲低内源性ATP5B基因使得circRNA SCAR与ATP5A的结合失效(图4E)，而沉默ATP5A基因对circRNA SCAR-ATP5B的相互作用没有明显的影响(图S4D)。
ATP5B固定在线粒体内膜的基质上。研究对外膜剥离的线粒体和有丝分裂体进行了纯化，观察到它们的circRNA SCAR水平具有可比性(图S4E和S4F)，表明circRNA SCAR并不主要位于外膜或膜间空间。为了研究ATP5B、circRNA SCAR和mito-NP是否在同一个空间中，研究采用了一种工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)标记方法来识别活细胞中RNA或蛋白质的特定线粒体区域。研究将以APEX为靶点的正常成纤维细胞转染到不同的区域，并使用链霉亲和素磁珠收获不同的部分。ATP5B和circRNA SCAR主要存在于基质和面向基质的内膜(基质-APEX)中，而不存在于膜间空间(IMS-APEX)或外膜(OMM-APEX)中(图4F-4H)。此外，研究将含有GFP表达载体的mito-NP应用于分别转染3种不同的APEX表达质粒的成纤维细胞。在基质-APEX沉淀的部分中主要检测到GFP(图S4G)。总之，这些数据表明ATP5B、circRNA SCAR和mito-NP在同一亚线粒体中。
本研究和其他人已经证明，非编码RNA通常通过茎环结构与蛋白质相互作用。因此，研究构建了一系列SCAR截断片段，发现nt 100-182的SCAR (SCAR100-182)，形成双链茎结构(图S4H)，与ATP5B相互作用(图4I)。此外，在circRNA SCAR表达的NASH成纤维细胞中，破坏配对区域的核苷酸突变消除了ATP5B RIP试验中增强的SCAR富集(图4J)和ROS抑制(图4K和S4I)。
虽然缺乏关于ATP5B-RNA结合的报道，但研究在一个已发表的质谱数据库中确定了ATP5B结构域(ILQDYK)是一个潜在的RNA结合区域。这6个氨基酸的突变，而不是相邻部分的突变，使得ATP5B不能与circRNA SCAR结合(图4L)。综上所述，这些数据表明circRNA SCAR中的100-182 motif与ATP5B中的区域ILQDYK结合。
5 circRNA SCAR通过阻断CypD-mPTP相互作用来关闭mPTP
mPTP的开放降低了ΔΨm，增加了mROS的生成和释放。circRNA SCAR抑制ROS输出和ΔΨm的降低，可以直接结合ATP5B，ATP5B是mPTP调节器。为了评估circRNA SCAR是否阻碍mPTP开放，研究采用calcein释放试验，发现棕榈酸盐导致calcein荧光明显下降，提示mPTP开放。更重要的是，circRNA SCAR过表达逆转了棕榈酸盐诱导的mPTP开放(图5A)。研究始终在NASH成纤维细胞中观察到类似的结果(图S5A)。探讨circRNA SCAR对mPTP开放的影响是否依赖于其与ATP5B的结合，研究应用了含circRNA SCAR突变体的mito-NP，其与ATP5B的结合被消除(图5B)。circRNA SCAR在calcein荧光上的过表达完全缺失(图5A和S5A)，提示与ATP5B结合对于circRNA SCAR关闭mPTP是不可或缺的。
CypD是mPTP打开的主要促进因子，与ATP合成酶结合，ATP5B位于ATP合成酶中。因此，circRNA SCAR是否会破坏CypD-mPTP的相互作用。免疫沉淀实验显示棕榈酸盐显著增强了CypD与mPTP的结合，而这一作用被野生型circRNA SCAR的过表达而明显抑制(图5C)。沉默CypD(图S5B)挽救了circRNA SCAR对棕榈酸盐处理过表达突变成纤维细胞mPTP开放的抑制作用(图5D)。同样，研究观察到对ΔΨm抑制(图5D)、ROS生成(图5E)、胶原蛋白收缩(图5E)和细胞因子产生(图5G)也有类似的效果。综上所述，这些数据表明circRNA SCAR直接结合ATP5B，干扰CypD-mPTP交互，阻止mPTP打开，减少mROS输出。
6 脂质诱导的内质网应激通过CHOP抑制PGC-1α介导circRNA SCAR表达
SCAR宿主基因所在的线粒体光链被转录为一个大的多顺反子前体转录本，然后被加工成功能单位。核编码剪接体的组成部分，包括eIF4A3和7个核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)，调节线粒体RNA的生物发生。确定其中是否有circRNA SCAR参与生物发生过程，研究用相应的小干扰RNA (siRNA)转染正常成纤维细胞。沉默hnRNPM，而不是其他(图S6A)，会增加circRNA SCAR水平和圆形/线形SCAR之间的比率(图6A)。事实上，CLIP-seq数据显示，SCAR 无拼接前体的外显子和侧翼内含子含有hnRNPM的结合位点(图6B)，RIP和qRT-PCR实验得到了验证(图6C)。此外，RNase L可以介导核circRNA的降解。有趣的是，虽然RNase L在线粒体中的分布远小于在细胞质中的分布(图6D)，沉默RNase L增加了poly(I:C)处理成纤维细胞的circRNA SCAR水平(图6E和S6B)。总的来说，这些结果表明mito-circRNAs不是随机的转录错误，而是在其形成和降解过程中受到调控。
脂质对circRNA SCAR的下调促使研究探索其表达机制。生物信息学分析确定了一个假定的PGC-1α位点，位于25 ~18bp的光链启动子，负责线粒体基因组中的circRNA SCAR转录(图6F)。ChIP实验显示抗PGC-1α抗体沉淀了此基序(图6G)。与circRNA SCAR表达一致的是，棕榈酸盐显著减少PGC-1α(图6H)及其与线粒体中假定基序的结合(图6G)。此外，沉默PGC-1α显著降低circRNA SCAR表达(图6I 和S6C)，表明PGC-1α调控circRNA SCAR转录。
脂质超载导致内质网应激。事实上，研究发现棕榈酸盐处理的成纤维细胞(图6J)和原发性NASH成纤维细胞(图6K)中内质网应激标志物上调。内质网应激的中介物CHOP可以抑制PGC-1α。为了研究CHOP是否抑制成纤维细胞中的PGC-1α，研究沉默了CHOP，观察到棕榈酸盐处理的成纤维细胞中PGC-1α的表达恢复到了与未处理成纤维细胞相当的水平(图6L)。PGC-1α表达同时敲低CHOP也减轻了棕榈酸盐诱导的circRNA SCAR抑制(图6M)。同样，研究在NASH成纤维细胞中观察到类似的效果(图S6D和S6E)。总的来说，这些结果表明脂质诱导的内质网应激拮抗剂PGC-1α依赖于CHOP的circRNA SCAR表达。
7 circRNA SCAR减轻高脂饮食诱导的小鼠肝硬化
虽然研究没有鉴定出circRNA SCAR的小鼠同源物，ATP5B的蛋白序列在人和小鼠中高度保守(96.22%)。使用人类非编码RNA与小鼠蛋白相互作用的治疗策略已经被证明。的确，人类circRNA SCAR可以与小鼠ATP5B结合(图S7A)。circRNA SCAR过表达抑制小鼠成纤维细胞中mPTP开放(图S7B)、cROS释放(图S7C)和胶原收缩(图S7D)。
为了评估mito-NP是否能在体内有效地导入肝成纤维细胞的线粒体，研究用Cy5荧光标记了circRNA表达载体。空载体或经mito-NP包封载体经尾静脉注射至小鼠体内。与空载体相比，mito-NP在主要器官中表现出更高的荧光信号。其中，肝脏mito-NP积累最高(图7A和图S7E)。为了调查细胞中mito-NP摄取的百分比，研究从肝脏中分离成纤维细胞。注入空载体和mito-NP后，成纤维细胞Cy5+的比例分别为20.32%±3.67%和74.12%±7.05%(图7B和S7F)。为了量化线粒体中mito-NP的积累，研究对细胞器进行了分离，观察到线粒体中mito-NP的富集量是细胞质的10倍以上(图7C和S7G)。
为了研究体内circRNA SCAR的治疗潜力，研究将含有mito-NP的circRNA SCAR过表达载体或空载体尾静脉注入小鼠，且每3天喂食高脂肪食物。研究没有观察到mito-NP对小鼠的明显毒性(表S2)。FISH和免疫荧光染色显示，在表达circRNA SCAR的mito-NP小鼠中，有86.07%±7.17%的circRNA SCAR信号与线粒体共定位(图7D和S7H)。分离成纤维细胞的细胞器分级检测显示，线粒体片段中的circRNA SCAR比细胞质中多14.92±1.79倍(图7E)。研究没有通过体内过表达circRNA SCAR检测到其线性表达(图7E)。
肝成纤维细胞线粒体中circRNA SCAR水平的升高伴随着ROS水平的抑制(图S7I)和细胞因子表达(图S7J)。更重要的是，在高脂喂养的小鼠中，表达circRNA SCAR的mito-NP的治疗显著提高了葡萄糖耐受性(图S7K)和胰岛素耐受性(图S7F)，阻止体重增加(图S7L)，减少肝纤维化和巨噬细胞浸润(图7G)。
8 circRNA SCAR与患者的脂肪变性发展为NASH相关
为了探讨circRNA SCAR的临床意义，研究用FISH评估了其在有无NAFLD的患者肝脏组织中的表达。circRNA SCAR位于线粒体中，主要在成纤维细胞中检测到(图7H)。更重要的是，与非NAFLD患者相比，NAFLD患者的circRNA SCAR表达明显降低，并由单纯脂肪变性持续变为NASH肝硬化(图7I和S7M)。此外，NAFLD患者肝脏标本中，成纤维细胞circRNA SCAR表达与cROS水平和纤维化程度呈负相关(图7I和7J)。此外，稳态模型评估-胰岛素抵抗(HOMA-IR)与circRNA SCAR+肝成纤维细胞百分比呈负相关(图S7N)。总的来说，这些结果表明，肝成纤维细胞中circRNA SCAR下调与患者脂肪变性转化为NASH进展以及胰岛素抵抗密切相关。
结论
综上所述，该研究揭示了线粒体定位的circRNA在代谢性炎症中发挥重要功能，并且率先构建靶向线粒体circRNA的纳米递送系统，实现在体内外干预线粒体定位circRNA，为靶向线粒体信号治疗代谢性免疫疾病提供新思路。通过干扰mito-circRNAs靶向一个被破坏的细胞器代谢轴为免疫代谢疾病提供了一个重要的治疗策略。
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