编译：月中霜，编辑：夏甘草、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
导读
藏鸡是适应高原低氧条件的独特鸡品种。许多阳性选择相关的基因已经在这类鸡中进行了报道。然而，对于缺氧适应基因表达机制尚不了解。在本研究中，将藏鸡和茶花鸡的卵在缺氧和常氧条件下进行孵育，然后观察胚胎绒膜尿囊膜（CAM）中的血管形成过程。研究人员发现，在缺氧条件下，藏鸡CAM中的血管密度指数低于茶花鸡。利用RNA-Seq和iTRAQ对低氧培养下的藏鸡和茶花鸡胚胎的CAM组织进行了转录组学和蛋白质组学分析。研究人员从中获得了160个差异表达基因（DEGs）和387个差异表达蛋白（DEPs），它们主要集中在血管生成、脉管系统发育、血管形态发生、血液循环、肾素-血管紧张素系统以及HIF-1和VEGF信号信号通路中。参与血管生成和血液循环的26个基因，涉及离子运输的2个基因和调节能量代谢的6个基因被确定为调节鸡胚低氧适应的候选功能基因。本研究为研究藏鸡低氧适应的分子机制提供了新的见解。
原名：Comparative transcriptomic and proteomic analyses provide insights into functional genes for hypoxic adaptation in embryos of Tibetan chickens
译名：转录组学和蛋白质组学比较分析为藏鸡胚胎缺氧适应功能基因的研究提供了新的思路
期刊：Scientific Reports
IF：3.998
发表时间：2020.07
通讯作者：张浩
通讯作者单位：中国农业大学动物科学技术学院
DOI号：articles/s41598-020-68178-w
作者将藏鸡和茶花鸡的卵分别在缺氧和常氧条件下进行孵育，在孵育的第6、10、14和18天，将卵从孵化器中取出，用于观察血管密度指数（VDI）；在孵化的第11天，从缺氧条件下采集了18个，藏鸡（n = 9）和茶花鸡（n = 9）的胚胎绒膜尿囊膜（CAM）样品，立即在液氮中冷冻，并在−80℃进行储存，用于转录组和蛋白组测序；最后通过转录组和蛋白组测序比较分析探究藏鸡胚胎缺氧适应相关功能基因。将藏鸡（TC）和茶花鸡（CH）的卵在低氧培养箱（13％±0.2％O2）和常氧培养箱（21％±0.2％O2）中进行孵育。在孵育的第6、10、14和18天对胚胎的CAM进行血管密度指数（VDI）测定。结果发现，在胚胎发育过程中，CAM中的VDI水平从第6天到第18天迅速增加（图1）。在孵育的第6天，TC和CH的低氧和常氧孵育之间，CAM覆盖的区域很小，VDI差异不大，这可能是由于在早期胚胎发育阶段，低氧对血管生成的影响尚不足以在VDI水平上观察到。孵育第10天，低氧培养条件下茶花鸡中CAM的VDI明显高于常氧（P <0.05）。然而，在TC中低氧和常氧孵育之间的VDI差异并不显着（P> 0.05）。低氧孵育下TC的VDI明显低于CH（P <0.05）;血管生成变钝，这可能是藏鸡中CAM血管的适应性特征。
每个RNA-Seq样品中，分别获得51.4–91.1 M的干净读数，其中74.30–78.90％被注释到了鸡参照基因组。大部分的映射读段分布注释的基因体区域中，其中66.85–69.02％位于注释的外显子中，而9.72–12.03％位于内含子中。在CAM组织中总共检测到14869个表达基因，其中14349个基因在TC和CH中共同表达。每个样品中表达基因的FPKM值大致在1-10和10-100之间（图2a），分布值在这六个样本中相似（图2b）。所有重叠基因的FPKM值的聚类热图显示三个重复样本可以聚类在一起。
在TC和CH组之间总共鉴定到160个DEGs（126个上调和34个下调）（图3a）。六个样本中，160个DEGs可以聚为两类，FPKM值的热图表明表达的DEG数量在组内具有良好的可重复性。DEGs富集的关键GO术语主要包括血管形态发生、脉管系统发育、血管生成、血液循环、炎症反应、离子转运、ATP结合以及其他相关生物学过程（图3b）。同时，具有代表性的KEGG通路主要包括代谢途径、粘附斑通路、MAPK信号传导途径、PPAR信号传导途径、脂肪酸代谢、钙信号传导途径、VEGF信号传导途径和HIF信号中的其他上游和下游途径（图3c）。此外，八个差异表达基因，分别是HSPB1（热激蛋白B家族1成员）、PRRX1（配对的相关同源蛋白1）、NRXN1（神经毒素1）、NGFR（神经生长因子受体）、IL8（白介素8）、ACE2（血管紧张素I转移酶2）、LVRN（laeverin）和CASQ2（钙螯合蛋白2），主要参与血管生成、血液循环、循环系统发育、VEGF信号通路和MAPK信号通路。两个差异表达基因，TF（转铁蛋白）和CACNA1H（钙电压门控通道亚基α1H）与离子迁移相关。两个差异表达基因，SDE（硬脂酰-CoA去饱和酶）和NR4A3（核受体亚家族4组A成员3），参与脂肪酸代谢、细胞呼吸、氧化还原过程和PPAR信号通路有关。根据功能注释，这10个DEG可能在鸡胚适应低氧环境过程中发挥重要作用。
利用6 Plex LC-MS / MS，检测到218,382个光谱，获得了18,900个肽段（表S5），其中17,015个独特肽段可以与3,767个蛋白相对应（表S6）（图4a）。在鉴定出的蛋白质上，1-5个肽占比72.59％（图4b），蛋白质分子量主要分布在10至80 kDa（71.92％）之间（图4c）。鉴定出的大多数蛋白质具有较高的肽段覆盖率（图4d），TC / CH的倍数变化大约接近1（图4e），表明良好的蛋白质序列覆盖率已经得到鉴定。变异系数小于20％的蛋白质所占比例超过90％，证明组内蛋白质具有生物可复制性（图4f）。
比较TC和CH，我们在TC中共检测到387个DEPs，包括249个上调和138个下调（图5a）。所有的差异表达蛋白主要被分为两类，组内具有良好的重复性，并且组间具有明显的多样性，这表明选定的DEP相对准确。387种DEPs的功能注释结果显示，GO术语主要富集到血管生成、血管发育、血液循环、氧结合、蛋白质激活级联、碳水化合物代谢过程和其他相关的生物学过程中（图5b）。KEGG富集通路主要包括HIF-1信号通路、VEGF信号通路、肾素-血管紧张素系统、Notch信号通路、血管平滑肌收缩、脂肪酸代谢和其他与HIF信号通路级联的通路（图5c）。19个DEPs（HSPB1，HK2，PPP1CB，Notch2，NUMB，MLST8，VAV2，ALB，EMP2，AGT，CTSA，NLN，PPP1R12A，STK4，NCALD，PLCB1，CKI，APOH和GNG2）主要参与血管生成、血管内皮细胞迁移、血液循环、血管平滑肌收缩、VEGF信号通路、HIF-1信号通路、肾素-血管紧张素与氧结合系统。TF基因具有铁转运功能，与血红蛋白的氧携带能力增加有关，并参与HIF-1信号通路。四种DEPs（FABP3，AKT2，IDH3B和SIRT5）参与与细胞呼吸和呼吸系统发育有关的能量代谢过程。根据功能注释，鉴定出20种DEP在藏鸡鸡胚胎适应缺氧环境中发挥潜在作用。
采用实时定量PCR验证9个选择的DEGs（CACNA1H，IL8，RRAD，TF，HSPB1，CCR5，CD4，FABP4和NOX4）其与RNA-Seq中的表达差异。结果显示，七个基因在TC和CH之间表现出明显不同的表达模式。此外，qRT-PCR和RNA-seq中所有9个基因的倍数变化都显示出相同的趋势。结果表明，在RNA-Seq中鉴定到的DEGs是可靠且有效的。为了进一步验证通过iTRAQ鉴定的DEPs，采用液相色谱平行反应监测/质谱分析（LC-PRM / MS）方法测定选择的20种蛋白质来的表达水平。结果表明，与CH相比，TC中有6种蛋白显著上调，而14种蛋白显著下调。另外，所有20种蛋白质的表达变化均与iTRAQ数据的倍数变化一致。整合由RNA-Seq检测到的14,869个基因和iTRAQ检测到的3,767个蛋白，其中2,764个基因在mRNA和蛋白质水平均具有所表达值，mRNA和蛋白质表达水平之间TC / CH倍数变化的皮尔逊相关系数为0.12。对于通过RNA-Seq检测到的160个DEGs和通过iTRAQ检测到的387 DEPs，其中发现有7个重叠基因，其中6个基因（HSPB1、TF、MYH11、BHMT、CAP2和DES）在比较TC /CH时具有相同的变化趋势，七个基因倍数变化的皮尔逊相关系数为0.21。这六个基因中的两个（HSPB1和MYH11）与血管生成和血管平滑肌收缩有关。TF基因作为转铁蛋白参与HIF-1α途径。BHMT基因与酸性代谢过程有关，CAP2和DES在细胞骨架组织中起作用。此外，在RNA-Seq中鉴定出的19个DEGs在iTRAQ检测中具有蛋白质表达值，倍数变化的皮尔逊相关系数为0.21。在iTRAQ中鉴定出的257个DEPs在RNAseq中具有mRNA表达水平，其倍数变化的皮尔逊相关系数为0.112。基于RNA的分析通常不能完全代表蛋白质动力学水平，研究人员的研究结果表明，藏鸡胚胎中的低氧适应过程可能发生大量的转录后调控过程。本文通过转录组和蛋白组探究藏鸡胚胎缺氧适应过程中可能的分子机制。结合两者分析结果，最终将参与血管生成和血液循环的26个基因，涉及离子运输的2个基因和调节能量代谢的6个基因确定为调节鸡胚低氧适应的候选功能基因。另外，藏鸡可能通过HIF-1和VEGF信号通路及其上游途径以及靶基因表达来调节血管生成，从而改变藏鸡胚胎对缺氧条件的钝化反应（图6）。该研究结果为后续研究藏鸡低氧适应性分子机制提供了理论基础。
更多推荐
1 高分综述 | Trends in Biotechnology: 单细胞分辨率下利用空间转录组揭示器官分子结构（国人佳作）
