编译：YQ，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
水稻（Oryza sativa）是人类重要的粮食作物，也是破译植物生长发育机制的模式植物。目前基于野生水稻的近等基因系（NILs）揭示了水稻形态结构、花序形成、胁迫反应和芒发育的关键基因。准确的基因翻译可确保蛋白质执行正常功能，其中tRNA是影响翻译的重要因子。tRNA通过不同位点的修饰正确破译遗传密码，例如酵母（Saccharomyces cerevisiae）中tRNA 34位尿苷（U34）的修饰影响翻译速率和蛋白质聚集，人类和小鼠中线粒体tRNA 37位腺苷的修饰影响线粒体相关疾病，水稻中组氨酸tRNA的修饰调控翻译效率。tRNA修饰由tRNA修饰酶催化，在原核和真核生物保守存在。这些基因中，tRNA修饰酶E家族（TrmE）直接修饰尿苷。系统发育分析表明植物的TrmE蛋白与蓝藻（叶绿体祖先）同源，表明植物TrmE蛋白可能修饰叶绿体tRNA，确保叶绿体基因的正常翻译。一般叶绿体基因组编码30个tRNA和约80个特异的蛋白质，薄层色谱表明大豆、大麦、刺松藻的叶绿体tRNA中存在少量的核苷酸修饰。然而目前研究叶绿体tRNA修饰酶功能的研究较少。本研究用非洲野生稻（Oryza longistaminata）的自然变异，揭示多效发育缺陷基因（PDD）在水稻生长发育的重要作用，表明PDD是一种定位于叶绿体的TrmE家族基因，参与叶绿体tRNA修饰，从而影响基因翻译和植物发育。
原名：A Natural Variation in PLEIOTROPIC DEVELOPMENTAL DEFECTS Uncovers a Crucial Role for Chloroplast tRNA Modification in Translation and Plant Development
译名：多效发育缺陷基因（叶绿体tRNA修饰酶）在基因翻译和植物发育中的重要作用
期刊：Plant Cell
IF：9.618
发表时间：2020.07
通讯作者：陆平利
通讯作者单位：复旦大学生命科学学院
DOI号：10.1105/tpc.19.00660
① 植物材料。F1群体通过187R（Oryza sativa subsp indica）和非洲野生稻（Oryza longistaminata）杂交获得，种植于中国上海、太仓、三亚。用分光光度法测定植株叶绿素和类胡萝卜素含量，便携式光合作用测定系统测定三叶期幼苗（暗适应1h）的Fv/Fm（最大光化学量子产量）。② 细胞学观察。制备植株第三片叶片超薄切片，用乙酸铀酰染色并在透射电子显微镜观察。植株茎节固定于甲醛-乙酸-乙醇溶液中，脱水清洗，嵌入塑化石蜡中，切片后转移至载玻片上，脱水脱蜡。亮视野显微镜观察细胞形态。③ PDD序列分析。PDD基因序列通过InterPro数据库进行结构域分析和功能预测，ChloroP预测叶绿体靶标信号，BLASTP查找同源基因，MEGA多序列比对及构建系统发育树。④ PDD功能分析。基于PDD基因片段构建重组质粒，经农杆菌介导转入非洲野生稻。基于PDD的CRISPR/Cas9基因编辑载体通过农杆菌导入187R。GFP-PDD重组载体转化到水稻原生质体，共焦扫描显微镜观察GFP荧光。ProPDD:GUS染色观察基因在植物内组织表达水平。酵母双杂交系统及双分子荧光互补验证PDD的二聚体形成。⑤ tRNA分析。密度梯度离心法从水稻幼苗中分离叶绿体，从叶绿体颗粒中提取<200nt的RNA，tRNA经消化后利用LC-MS/MS检测核苷酸修饰。⑥ 蛋白质分析。从水稻幼苗叶片中分离总蛋白，用SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维素膜，用多种抗体进行免疫印迹。⑦ 转录组分析。分离水稻幼苗叶片总RNA，进行Illumina RNA-seq，AgriGO进行GO富集分析。
1、PDD基因的自然变异导致多效性发育缺陷
为通过自然变异识别水稻功能基因，本研究通过187R品种和非洲野生稻的杂交后代，发现F2群体典型的多效性发育缺陷，且该缺陷由单隐性等位基因引起。基于该缺陷的表型，将正常植株命名为PDD-187R，发育缺陷植株命名为PDD-OL。表型分析表明，在五叶期前PDD-OL呈现新叶白化，在苗期有白化边缘（图1A-B）。三叶期PDD-OL的光合色素含量远低于PDD-187R，但在发育后期恢复正常（图1C）。利用透射电镜观察叶绿体超微结构，发现PDD-187R叶绿体具良好的层状结构（图1D-E），相比PDD-OL细胞严重空泡，叶绿体缺乏层状结构（图1F-G），但在后期发育中叶绿体良好。比较PDD-187R与PDDOL的光合能力，在三叶期PDD-OL的PSII最大光化学量子产量显著较低。此外，PDDOL植株株高和分蘖数显著下降（图1H-J），其圆锥花序比PDD-187R更短，分枝更少，节间距更短（图1K-L）。显微观察显示PDD-OL的细胞尺寸较小（图1M）。此外，虽然PDD-OL的籽粒大小和187R相似，但植株的穗粒数、结实率、粒重均有所下降，严重导致单株产量下降。
图1 PDD-OL表型分析。A-B：三叶期和五叶期表型；C：三叶期叶片色素含量；D-G：三叶期的叶片透射电镜图，红色箭头表堆叠基粒；H：成熟期表型；I-J：株高和分蘖数；K：茎结构表型，红色箭头表节点；L：圆锥花序长度和节间长度的比较；M：节间横截面的显微观察。
2、PDD的图位克隆和鉴定
为鉴定引起PDD-OL植株多效性缺陷的基因，本研究进行图位克隆。利用PDD-OL和187R杂交的F2群体，初步将PDD-OL位点定位到8号染色体长臂上（图2A），其中CG1和CG3是成对重复基因，CG2、CG4、CG5分别为蛋白编码基因、tRNA修饰酶TrmE、肽酶。本研究构建187R的CG4和CG5的重组质粒载体导入PDD-OL（图2B），结果表明CG4的表达使PDD-OL正常表型（图2C-D），包括色素含量、分蘖数和株高。而CG5的表达PDD-OL依然发育缺陷。因此，CG4位点（tRNA修饰酶TrmE）是PDD（多效发育缺陷）基因。为验证PDD基因功能，通过CRISPR/Cas9介导基因编辑构建PDD突变体。本研究将PDD第一和第二外显子作为靶标（图3A），获得15株187R突变体（包括5种不同编辑的等位基因），pdd-2/pdd-3和pdd-4/pdd-5均在五叶期之前死亡，表明突变等位基因有害性太大，而pdd-1纯合植株可进行进一步研究。序列分析表明pdd-1产生过早终止密码子，导致截短蛋白只有5’端氨基酸。表型分析表明pdd-1突变株表现严重的发育缺陷（图3B-E），验证了PDD-OL的多效发育缺陷来源于CG4位点。且种子萌发实验表明pdd-1种子可发芽但不能形成幼苗（图3F-G），这说明该PDD基因对水稻发育十分重要。
图2 PDD基因的图位克隆和鉴定。A：PDD位于8号染色体，包含5个编码基因；B：CG4过表达载体，HPT（抗性基因），NOS（合成酶终止子）；C-D：CG4过表达体在苗期和成熟期表型。
图3 187R pdd突变体和表型。A：CRISPR/Cas9获得的pdd突变序列；B-C：pdd-1突变体在苗期和成熟期表型；D-E：pdd-1株高和分蘖数。F-G：pdd-1幼苗生长表型。
3、PDD编码叶绿体tRNA修饰酶的功能分析
本研究的PDD基因被注释为tRNA修饰酶（具有GTP酶活性），蛋白质结构的预测表明PDD具有叶绿体靶向信号，分别在N端保守的120个氨基酸、约170个氨基酸的G结构域（GTP酶活性）、C端保守的CxGK基序（图4A）。序列比对显示，该蛋白有R1和R2两个保守区域（图4A）。qPCR表明PDD转录本在绿色组织高表达，包括苗期叶片、分蘖期叶片和鞘，在根茎茎华中表达较低（图4B）。GUS报告基因构建的载体和染色表明叶片、种子胚胎、根、花序中均有表达活性（图4C）。Pro35S:PDD187R-eGFP荧光表达载体表明PDD定位于叶绿体（图4D）。PDD-187R和PDD-OL的序列比对显示468个SNP和插入/缺失片段，PDD-OL的蛋白编码区包含一个6bp缺失和28个SNP，这些变异导致2个氨基酸的缺失和5个氨基酸的改变（图5A）。通过构建PDD-OL表达载体（图5B），导入PDD-OL植株，植株均表现发育缺陷（图5C-D）。说明PDD-OL是一种功能障碍蛋白。qPCR表明PDD-OL基因的表达水平高于187R，而叶绿体定位并未受影响。酵母双杂交和双分子荧光互补表明PDD-187R可形成同型二聚体，而PDD-OL则不能（图5E-F）。通过在大肠杆菌中纯化表达PDD蛋白，表明PDD-187R有较强的GTP酶活性，而PDD-OL活性受损。因此，PDD-OL属于PDD基因的自然变异，导致了该蛋白无法形成同型二聚体，GTP酶活性受损。本研究利用LC-MS/MS测定叶绿体的tRNA修饰。从三叶期幼苗叶片的叶绿体提取tRNA，消化成单核苷后作为LC-MS/MS注射样品（图6A）。分析鉴定18个修饰核苷酸（图6B-D），其中17个在187R和OL间没有显著差异，而OL中有个5-甲基氨基甲基-2-硫脲（mnm5s2U）修饰水平明显低于187R（图6E-G），而互补株系可恢复修饰水平（图6H）。因此，该PDD与水稻叶绿体tRNA的mnm5s2U修饰有关。
图4 PDD的表达水平与亚细胞定位。A：PDD基因结构，CTS（叶绿体靶向信号）；B：qPCR分析PDD在不同组织的表达水平，L-S（苗期叶片），L-T（分蘖期叶片），P（圆锥花序），R（根），S（茎）；C：GUS表达株染色；D：PDD的GFP亚细胞定位。
图5 PDD-187R和PDD-OL序列及变异分析。A：氨基酸变异；B：PDD-OL表达载体；C：PDD-OL转基因株系表型；E：酵母双杂交验证PDD同型二聚体的形成；F：双分子荧光互补检测PDD同型二聚体的形成；G：PDD-187R和PDD-OL的相对GTP酶活性。
图6 叶绿体tRNA修饰分析。A：实验步骤；B-D：18个分离良好的修饰核苷酸；E-G：187R和OL中修饰核苷酸的相对丰度；H：三叶期mnm5s2U修饰的相对丰度；I：六叶期mnm5s2U修饰的相对丰度。
4、PDD自然变异对基因表达的影响
本研究利用免疫印迹分析三叶期187R和OL四种关键蛋白的表达水平，包括PSI亚基PsaB、PSII亚基D1和D2、二磷酸核酮糖羧化酶RbcL。与187R相比，PDD-OL中D1和D2无表达水平，RbcL和PsaB水平显著下降（图7A），表明PDD-OL对光反应和固碳反应的蛋白均有较大影响。此外，测量了叶绿体转录翻译系统相关的蛋白水平，包括RNA聚合酶（RpoA、RpoB、RpoC2）、核糖体（RPS2、RPS3、RPS12、RPL2、RPL16）亚基。结果表明PDD-OL中RpoA、RpoB和RpoC2的水平高于187R，但核糖体亚基蛋白水平明显降低，表明叶绿体中核糖体亚基的积累严重受损。qPCR表明在PDD-OL中光合作用相关基因mRNA水平显著降低，而RNA聚合酶相关基因mRNA水平显著升高（图7B）。与187R相比，NIL-PDDOL中16S和23S rRNA水平显著降低（图7C），表明PDD-OL中叶绿体核糖体的生物合成受到很大影响。本研究通过RNA-seq对比三叶期187R和OL的叶绿体基因表达谱。共获得48个差异表达基因，OL中27个下调基因，21个上调基因（图8）。叶绿体基因按转录方式分为3种：由PEP转录、由NEP和PEP转录、由NEP转录。PDDOL中I类基因的mRNA水平降低，如psi相关基因、rbcL基因，而编码叶绿体核糖体蛋白亚基的III类基因在PDD-OL中表达水平显著提高。本研究进一步研究PDD-OL的核基因表达变化。与187R相比，上调基因1520个，下调基因2377个（图9A）。在上调基因中，基因富集于碳水化合物/多糖代谢、应激反应、细胞氮化合物代谢和二萜代谢（图9B），功能类别水平上水解酶活性、肽酶抑制剂活性和阳离子结合的富集程度最高。在下调基因中，光合作用、氧化还原、离子转运、碳固定和细胞壁组织显著富集，分子功能类别富集于氧化还原酶活性、四吡啶（叶绿素前体）结合、转运体活性（图9C）。这些结果表明PDD-OL光合作用相关核基因（PhANGs）的表达受到抑制。
图7 PDD-OL中叶绿体蛋白质表达水平。A：免疫印迹分析；B：qPCR分析叶绿体基因相对表达量；C：生物分析仪对187和OL进行rRNA分析。
图8 187R和PDDOL中叶绿体编码基因的差异表达。
图9 187R和PDDOL中核基因的差异表达。A：差异表达基因数目；B：上调基因GO富集；C：下调基因GO富集；D：下调基因热图。
1、叶绿体tRNA修饰酶对植物生长发育是必需的
研究表明，tRNA修饰酶的丧失可能导致发育缺陷，如小鼠的胚胎性坏死、线虫的神经元功能障碍、植物发育缺陷。本研究发现一个定位于叶绿体的水稻tRNA修饰酶，其自然变异导致水稻多效性发育缺陷。因此，该位点是水稻正常发育必需的。而非洲野生稻可能通过其他机制弥补PDD基因的功能障碍。在人类和酵母中，TrmE家族蛋白靶向线粒体，本研究发现的TrmE定位于叶绿体，这说明TrmE主要在半自主细胞器发挥作用。
2、PDD基因自然变异抑制光合作用相关基因表达
叶绿体发育和基因表达受细胞核基因的信号调控，而植物衍生出叶绿体逆行信号，影响核基因表达，如光合作用相关基因（PhANG）。本研究表明PDD的功能缺陷（PDD-OL）导致mnm5s2U的tRNA修饰缺失，影响叶绿体的翻译。RNA-seq表明PDD-OL中多数叶绿体编码基因下调，而NEP转录的基因表达水平升高。PDD-OL中PhANG和扩张蛋白的表达水平降低可能导致细胞通过降低植物生长来保存能量，使得植株存活。综上，本研究得出187R和OL水稻品种的PDD分子机制（图10）。在187R中，PDD将叶绿体tRNA的尿苷修饰mnm5s2U，确保叶绿体基因有效翻译，植物正常发育。在OL中，PDD功能缺陷使叶绿体tRNA修饰减少，影响基因翻译效率。叶绿体的翻译异常使核基因光合蛋白表达水平下降，导致白化表型，且细胞核PhANG和扩张蛋白的表达水平降低导致植株矮小。
图10 PDD分子机制。
许多研究表明tRNA修饰酶影响生物发育过程，但植物细胞器tRNA修饰酶的功能机制研究较少。本研究表明PDD-OL是多效发育缺陷基因的自然变异等位基因，导致非洲野生稻的多效发育缺陷。图位克隆显示PDD编码一个叶绿体tRNA修饰酶，主要在叶片表达，与叶绿体tRNA的5-甲基氨基甲基-2-硫脲修饰有关。PDD的自然变异严重降低了参与光合作用和核糖体生物生成的蛋白质水平，但增加了质体编码的RNA聚合酶亚基水平。且PDD的缺陷改变了叶绿体基因表达，从而影响了叶绿体与细胞核之间的信号转导。
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