科研 | SETD2通过整合EZH2和AMPK信号通路来限制前列腺癌的转移（国人佳作）
编译：子涵，编辑：景行、江舜尧。
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前列腺癌（PCa）仍然是全世界男性癌症死亡的主要原因。局部肿瘤患者预后良好，而转移患者5年生存期下降至30%。晚期PCa的标准治疗包括雄激素剥夺疗法，该方法能在最初抑制肿瘤，但是在去雄难治性前列腺癌(CRPC) 中复发。基因组和转录组学分析的顶点发现致癌基因和肿瘤抑制基因的改变，例如AR、PTEN、TP53以及RB1，以及异常活化的关键信号通路是PCa转移的驱动因子。组蛋白甲基转移酶（HMTs）和去甲基化酶导致PCa转移。HMT EZH2能够修饰抑制性的H3K27me3，使细胞获得侵袭性的特征。研究者发现H3K36组蛋白二甲基化转移酶WHSC1能够与Pten协同作用驱动PCa的转移。在哺乳动物中，SETD2是催化H3K36me3的主要甲基转移酶。SETD2介导的H3K36me3的水平与EZH2催化的H3K27me3的水平成反比。然而，尚不清楚这两种酶活性是否在分子上有关联。在本研究中研究者发现SETD2通过其底物EZH2延迟前列腺癌（PCa）转移，SETD2甲基化EZH2，从而促进EZH2降解。SETD2缺失会引起Polycomb抑制的染色质状态，进而使细胞能够获得转移性状。相反，携带无法甲基化的EZH2突变体或者与EZH2结合缺陷的SETD2突变体的小鼠会产生转移性PCa。此外，研究人员发现二甲双胍刺激的AMPK信号会影响FOXO3来刺激SETD2表达。总之，这些结果表明SETD2-EZH2信号轴整合了代谢和表观遗传信号，进而限制PCa的转移。
论文ID
原名：SETD2 Restricts Prostate Cancer Metastasis by Integrating EZH2 and AMPK Signaling Pathways
译名：SETD2通过整合EZH2和AMPK信号通路来限制前列腺癌的转移
期刊：Cancer Cell
IF：26.602
发表时间：2020年9月
通讯作者：秦骏、江军、王晓明
通讯作者单位：中国科学院上海营养与健康研究所秦骏研究组、重庆军医大学大坪医院江军研究组、南京医科大学王晓明研究组
DOI号：10.1016/j.ccell.2020.05.022
实验设计
结果
为了确定SETD2在PCa中的重要性，研究者比较了代表惰性肿瘤Pten-/-小鼠和转移PCa的Pten-/-; Trp53-/-小鼠前列腺裂解液中H3K36me3/SETD2以及H3K27me3/EZH2的水平，结果发现H3K27me3和EZH2的水平与小鼠肿瘤进展正相关，并且在转移肿瘤中的表达水平高于惰性肿瘤（图1A）。重要的是，SETD2/H3K36me3以及EZH2/H3K27me3在小鼠前列腺组织中是互斥的（图1A）。因此研究者致力于确定PCa中SETD2的临床相关性。qRT-PCR的实验证实SETD2在前列腺肿瘤中的表达降低。公共数据集分析发现SETD2在CRPC和NEPC中的表达进一步降低，侵袭性的PCa亚型倾向于转移。此外，研究者发现SETD2 mRNA水平与疾病复发负相关。为了拓展这一结果，研究者利用SETD2抗体在肿瘤组织芯片上进行了IHC染色，如图1B，SETD2低表达的患者具有更短的无复发生存期。具有较高格林森分数（GS）的患者SETD2的表达降低（图1C）。多变量分析也发现SETD2负载预后价值，不依赖于前列腺特异的抗原水平和GS值。总之，这些结果表明SETD2在限制PCa进程中的作用。
研究者接下来进行了类器官实验以确定SETD2的功能是否是细胞自发的方式。研究者从2个月大Pten-/-小鼠中分离得到管腔细胞，并且在Pten缺失类器官中利用病毒稳转的shRNA敲除SETD2。结果发现Setd2沉默提高了类器官形成的能力（图1D、E）。在Setd2不足的类器官中Ki67+增殖细胞，而不是CD8+管腔细胞或者P63+基底细胞，频率升高（图1F）。由于SETD2的表达在转移肿瘤中下调，研究者通过dCas9- GCN4-调节的CRISPR活化在Pten-/-; Trp53-/-类器官中过表达SETD2（图1G）。结果发现SETD2的表达使这一致死亚型类器官的形成受损（图1H）。这些结果表明SETD2在PCa中非常重要。
图1. SETD2对PCa具有重要的临床和功能意义。（A）对小鼠前列腺裂解液中指定蛋白进行免疫印迹分析；（B）基于TMA中SETD2的表达进行IHC染色和Kaplan-Meier复发分析；（C）在TMA中依据GS值对SETD2的IHC分值分类；（D）对两个月大Pten-/-小鼠前列腺产生类器官中的SETD2进行IB分析；（E）对类器官形成的效率和到校进行成像和定量；（F）对特定部位进行免疫染色；（G）在两个月大Pten-/-; Trp53-/-类器官中过表达SETD2进行IB分析。（H）两个月大Pten-/-; Trp53-/-类器官中过表达SETD2进行类器官形成效率和大小的成像和定量分析；
2 Setd2与Pten协同缺失导致PCa转移
为了证实Setd2在体内的功能，Setd2floxed/floxed小鼠与前列腺上皮Probasin-Cre Setd2的小鼠交配。病理组织分析发现Setd2-/-动物畸形生长或者多灶性低级别前列腺瘤变(LGPIN)。Setd2-/-小鼠源系PIN病变呈筛状和/或管状结构组织。然而，在接下来的16个月，研究者并未检测到腺瘤的发展，表明只有Setd2缺失不足以驱动PCa。因此研究者将Setd2-/-小鼠与Ptenfloxed/floxed小鼠交配产生Pten+/-; Setd2-/-小鼠。所有Pten+/-; Setd2-/-小鼠15个月大部分死于膀胱出口梗阻（肾水肿），而Pten+/-小鼠存活超过20个月（图2A）。MRI成像发现相较于对照组，在8-至10-个月大的Pten+/-; Setd2-/-小鼠中平均前列腺肿瘤的体积大约5-至8-倍升高（图2B）。与8-10个月发展中LGPIN的Pten+/-小鼠相反，Setd2缺失导致高度前列腺上皮内瘤变的进展加快，在5-6月开始，8-10月发展为转移性肿瘤（图2C-E）。相应的，Ki67染色的增加表明Setd2缺失赋予了细胞增殖的优势。重要的是，Setd2缺失小鼠肿瘤周边平滑肌鞘明显受损，表明肿瘤发展为转移性的PCa（图2D）。因此，管腔来源的前列腺肿瘤细胞侵袭至基底。与此对应的，Setd2缺失的PCa在AR-或者CK8-阳性肿瘤结节中表现出广泛的转移范围，包括腰椎淋巴结、肺、肾脏、肝脏等（图2E）。此外，在8个月大Pten+/-; Setd2-/-小鼠外周血和远端器官也检测到Cre敲除的Pten或者Setd2重组等位基因，表明转移肿瘤的前列腺起源以及血管扩散（图2F）。总之，Setd2失活以及Pten缺失促进了PCa转移。
图2. Setd2与Pten协同缺失导致PCa转移。（A）Kaplan-Meier对Pten+/-以及Pten+/-; Setd2-/-小鼠的生存期进行分析；（B）MRI分析如图所示，定量的数据在右侧显示（n=6）；（C）对组织学分级进行定量（n=10），**p < 0.01；（D）对特定时间前列腺SMAa进行H&E染色和IHC染色；（E）对8-10个月大Pten+/-; Setd2-/-小鼠组织进行H&E以及AR、CK8染色；（F）在特定组织中检测Cre敲除的Pten以及Setd2重组。
3 Setd2缺失诱导的PCa转移依赖于EZH2活性升高
为了探究Setd2缺失如何提高转移的特征，研究者对三个月大Pten+/-以及Pten+/-; Setd2-/-小鼠来源的类器官进行了转录组学分析，来鉴定早期的驱动事件。Setd2缺失导致492个基因受到抑制，且299个基因产生（图3A）。信号通路和基因集富集分析表明所有差异表达的基因在EZH2和H3K27me3信号显著富集。qRT-PCR分析也证实了Setd2缺失的类器官细胞中EZH2直接抑制靶基因的表达的确降低（图3B）。有趣的是，对小鼠前列腺和PCa细胞分析发现Setd2缺失导致EZH2和H3K27me3水平的升高，但是不影响EZH2 mRNA水平（图3C）。EZH2表达的升高在Setd2缺失小鼠正常前列腺管腔细胞中也检测到（图3C）。同样，研究者发现C4-2细胞中SETD2敲除（KD）能够显著稳定EZH2（图3D）。为了证实这一发现，研究者利用ChIP-seq分析了H3K27me3。在Setd2缺失的类器官细胞中检测到H3K27me3的信号升高（图3E）。图3F中基因组也说明在Setd2缺失细胞中EZH2靶基因Cdkn2a、Sox7的转录抑制伴随H3K27me3的水平升高。总之，这些结果表明SETD2缺失导致PCa细胞Polycomb抑制的染色质状态。
研究者猜想这些结果是否具有临床相关性。对免疫印迹结果定量发现高GS患者中H3K36me3 vs H3K27me3、SETD2 vs EZH2之间负相关。考虑到在转移性CRPC中EZH2的表达最高并且与神经内分泌亚型相关，研究者进一步分析发现在CRPC和NEPC患者中SETD2的表达与EZH2的特征负相关。研究者也进行了免疫染色实验对晚期PCa中的SETD2和EZH2进行描述，包括高GS的腺瘤、CRPC以及NEPC，结果发现这两个蛋白之间的负相关（图3G）。这些结果说明在PCa中存在敌对的表观机制剥夺EZH2。
为了确定Setd2缺失是否会通过EZH2上调促进前列腺癌的发生发展，研究者在Pten+/-类器官中敲除Setd2的同时敲除了EZH2。与之前的报道一致，Ezh2缺失并没有导致可识别的缺陷，可能是由于Pten+/-小鼠中EZH2水平很低。相反，在Pten+/-; Setd2-/-类器官中敲除Ezh2使Setd2缺失引起的过量生长受到削弱。EZH2最主要的功能是作为PRC2复合体的酶促亚单元催化H3K27me3。利用EED的变构抑制剂EED226或者EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126处理导致Setd2不足类器官的生长减弱，同时伴随H3K27me3水平降低。研究者将Ezh2-floxed小鼠与Pten+/- ; Setd2-/-小鼠交配。尽管在Pten+/-; Ezh2-/-以及Pten+/-小鼠前列腺组织中没有显著差异，Pten+/-; Setd2-/-小鼠中Ezh2缺失减弱了前列腺癌的进展（图3H、3I）。重要的是，研究者整合RNA-seq数据发现Pten+/-; Setd2-/-细胞中Ezh2缺失导致超过半数SETD2调节的基因(441/791)恢复表达至Pten+/-类器官的水平（图3J）。总之，这些结果表明Setd2缺失以EZH2依赖的方式加速了前列腺癌的发生发展。
接下来研究者探究了Setd2不足细胞中EZH2聚集如何驱动促癌的机制。研究者将基因表达数据与H3K27me3 ChIP-seq数据整合，以探究EZH2直接调控的靶基因。在Setd2缺失基础上有128个基因下调并且获得H3K27me3，通过Ezh2 KO补救，研究者将其命名为依赖EZH2的SETD2特征。研究者证实在Pten+/-; Setd2-/- Ezh2细胞中缺失确实能够减弱代表性基因的降低。研究者选取了10个基因(Cdkn2a, Dab2ip, Epha7, Sox7, Vash1, Adrb2, Ephb6, Fbxo31, Gas1以及Timp4)进一步进行功能分析。结果发现敲除Cdkn2a, Dab2ip, Epha7, Sox7,以及Vash1能够促进Pten无效类器官的生长。Cdkn2a, Dab2ip以及Vash1有助于EZH2促进肿瘤的发生发展。有报道称在其他肿瘤模型中Sox7和Epha7是肿瘤抑制基因。因此这些结果表明Cdkn2a, Dab2ip, Epha7, Sox7以及Vash1可能有助于PCa中SETD2发挥功能。
图3. Setd2缺失诱导的PCa转移依赖于EZH2活性升高.（A）小提琴图说明3个月大小鼠指定类器官间差异表达的基因，代表基因如图；（B）热图总结了三个月大小鼠产生的类器官qRT-PCR验证的结果；（C）对6个月大小鼠前列腺中指定蛋白进行IHC分析；（D）CHX处理的对照组或者SETD2 KD组中C4-2细胞的IB分析，条形图代表EZH2蛋白的水平，**p < 0.01.（E）热图分析显示在3个月大小鼠产生的类器官中TSS -2 kb~TES +2kb的H3K27me3上13412个基因峰图；（F）在Cdkn2a和Sox7基因位点上H3K27me3的RNA-seq以及ChIP-seq轨迹；（G）热图显示在PCa中SETD2和EZH2之间的IHC值。（H）8个月大小鼠指定前列腺的H&E染色；（I）对组织学等级进行定量（n=8），**p < 0.01；（J）热图总结了3个月大小鼠类器官中差异表达的基因。
4 SETD2介导的K735me1促进了EZH2依赖Smurf2的降解
接下来研究者探究了EZH2是否是SETD2非组蛋白底物。首先研究者发现外源和内源的SETD2能够与EZH2相互作用，而不是EZH1（图4A、4B）。PRC2的主要成分EED以及SUZ12也与SETD2存在相互作用（图4B）。重要的是，SUZ12/EED与SETD2相互作用的比例低于EZH2，表明SETD2与PRC2复合体之间的关联相对较弱。同时也表明SETD2/EZH2相互作用可能通过阻止EZH2进入PRC2复合体或者破坏其与PRC2其他成分之间的相互作用。研究者构建了编码SETD2的氨基酸1–900, 900–1,720, 1,720–2,564以及 1,460–1,720的载体，分别将它们命名为F1、F2、F3和SET，结果发现SETD2-F2和SET与EZH2相互作用。重组的GST-SETD2-F2与EZH2直接相互作用。由于全长SETD2的异源表达极其困难，研究者在接下来的实验中利用SETD2-F2，因为该截断体能够直接与EZH2相互作用，并且保留了甲基转移酶的活性。利用泛甲基化的抗体，在SETD2-F2过表达的裂解液中检测到了EZH2的甲基化。相反在酶失活的SETD2-F2突变体不能使EZH2甲基化。研究者进行质谱分析发现一个保守的赖氨酸残基K735通过SETD2-F2过表达一甲基化。基础甲基化K421和K698也检测到，但是SETD2-F2不能诱导产生。因此，研究者致力于探究K735me1对EZH2表达和功能的影响。为了检测K735甲基化的特异性，研究者构建并证实了K735me1的抗体。体外甲基化实验证实SETD2直接甲基化EZH2 K735残基，相反，将K735残基替换为R（K735R）消除了甲基化（图4C）。随后IHC分析说明3个月大Pten+/-; Setd2-/-小鼠前列腺管腔细胞并未检测到K735me1信号，但是EZH2的水平升高（图4D）。利用MG132处理稳定EZH2发现K735me1的升高，而Setd2缺失降低K735me1（图4E）。因此这些结果表明SETD2能够直接甲基化EZH2。
为了探究负载K735me1 EZH2的比例，研究者利用MG132处理细胞以及anti-K735me1抗体进行了IP实验。该抗体能够特异性的使上清中的K735me1缺失，并且大约50%的EZH2残留。利用MS分析，研究者发现MG132处理使C4-2细胞中含有EZH2-K735me1的肽段数量显著增加（图4F）。这一半定量的实验表明大量EZH2被甲基化并且降解。由于EZH2是PRC2复合体的一部分，并且能够催化H3K27me3，研究者对PCa细胞进行了凝胶过滤色谱分析，结果发现K735me1大量存在于PRC2复合体中。同时研究者也在MG132处理的C4-2细胞中进行了anti-EED IP，结果都检测到了SETD2和K735me1，且K735me1的比率与input具有可比性。重要的是有报道称EZH2独立于PRC2，存在于晚期PCa中。研究者进一步探究了EZH2-K735me1的生化结果。在SETD2-F2存在时，K735R突变体蛋白半衰期升高，同时多聚泛素化显著降低。为了证实这一结果，研究者在C4-2细胞中利用CRISPR/Cas9将内源K735替换为R(C4-2K735R细胞)。与C4-2K735R细胞中EZH2蛋白升高一致，内源EZH2-K735R蛋白K735me1和多聚泛素化显著降低（图4G）。此外，EZH2突变体蛋白的降解对SETD2-F2并不敏感（图4H）。由于EZH2上调，促进了C4-2K735R细胞的肿瘤进展以及对SETD2- F2耐药（图4I）。近期的研究表明EZH2自身甲基化发生在其他位点(K510, K514, 以及K515)。研究者发现SETD2缺失并不改变EZH2在这些位点的甲基化，同时EZH2催化突变体(EZH2-H689A)也并未改变K735me1。因此，K735,K510, K514, 以及K515甲基化可能不依赖于该机制的调节。
接下来研究者旨在确定K735me1通过什么机制导致EZH2破坏。Smurf2, b-TrCP,以及TRAF6是已知的能够靶向EZH2降解E3。研究者发现Smurf2是最可能的E3连接酶调节EZH2的稳定。同样，Smurf2加速WT EZH2降解，而不是K735R突变体蛋白（图4J）。机制上而言，研究者进行了IP实验并且检测到C4-2K735R细胞中EZH2与Smurf2之间的关联减弱（图4K）。这些结果表明SETD2诱导的K735me1促进了Smurf2 E3连接酶识别EZH2并且对其进行降解。
图4. SETD2介导的K735me1促进了EZH2依赖Smurf2的降解。对转染指定质粒的293T细胞的全细胞裂解液(WCLs) 和IP进行IB分析；（A）对C4-2和LNCaP细胞的WCLs和IP进行IB分析；（B）体外甲基化实验对EZH2-K735me1进行IB分析；（C）对3个月大小鼠前列腺K735me1和EZH2进行IHC分析；（D）3个月大小鼠前列腺产生的类器官在20 mM MG132处理8小时后对K735me1进行IB分析；（E）通过MS定量有无20 mMMG132处理8小时的C4-2细胞中甲基化和未甲基化EZH2-K735肽段，**p < 0.01；（F）对WT和C4-2K735R细胞指定蛋白进行IB分析；(H-I) 对WT和C4-2K735R细胞在有无SETD2-F2过表达的情况下对指定蛋白进行IB（图H）和肿瘤体积（图I）分析，**p < 0.01；(J) 对有无Smurf2过表达的WT, SETD2 KD, 以及C4-2K735R细胞WCLs进行IB分析；（K）对有无SETD2-F2过表达指定细胞的WCLs和anti-EZH2 IP进行IB分析。
5 EZH2-K735me1对PCa进展非常重要
为了证实体内K735me1的重要性，研究者构建了纯合K735R敲入突变体(Ezh2K735R)小鼠。IHC分析表明Ezh2K735R小鼠前列腺管腔细胞中K735me1水平减弱，同时EZH2的表达升高（图5A）。Pten+/-背景下Ezh2K735R导致肿瘤进展加快（图5B）。SMAα和AR染色证实30% Pten+/-; Ezh2K735R小鼠发展为转移型腺瘤。这一结果与EZH2表达升高促癌的结论一致，然而疾病没有Pten+/-; Setd2-/-小鼠中严重。因此研究者探究了Pten无效小鼠中Ezh2K735R突变体(Pten-/-; Ezh2K735R)能够导致转移型PCa。通过H&E, SMAa, CK8, 以及Ki67染色发现在16周，Pten-/-; Ezh2K735R小鼠高度转移（图5C）。Pten-/-; Ezh2K735R负荷乳腺癌小鼠中AR-或者CK-8阳性细胞转移至腰淋巴结(7/10)和肺(4/12)（图5D）。这些表型表明EZH2- K735me1缺乏促使PCa细胞演变为转移型PCa。
此外研究者从2个月大Pten-/-以及Pten-/-; Ezh2K735R小鼠中分离得到管腔细胞，并且比较了它们体外形成类器官的能力。K735me1缺乏导致类器官形成的能力提高。重要的是，SETD2过表达或者KO对Pten-/-; Ezh2K735R小鼠源性类器官的生长没有影响（图5E、5F）。这一观察与类器官中K735me1, EZH2,以及Ki67+的水平相关。此外，研究者比较了2个月大Pten-/-和Pten-/-; Ezh2K735R小鼠产生类器官的转录图谱，结果发现Pten-/-; Ezh2K735R细胞中，与H3K27me3信号相关的特征显著富集，并且60% EZH2依赖的SETD2特征（74/128）。研究者证实EZH2-K735R突变体中EZH2抑制的靶基因降低。总之，这些结果表明SETD2的肿瘤抑制功能大部分依赖于EZH2的甲基化。
为了进一步探究EZH2- K735me1在PCa中的临床意义，研究者通过基于TMA的IHC比较了SETD2, EZH2,以及K735的甲基化水平。这些组织依据免疫染色分值分为SETD2、EZH2和K735me1高水平和低水平的群组。如图5G，SETD2的高表达与EZH2-K735me1的高表达以及EZH2的低表达高度相关。此外，低水平的K735me1也与临床差的预后密切相关（图5H）。因此，在患者中SETD2、EZH2以及EZH2-K735me1之间紧密关联。
图5. Ezh2甲基化缺陷促进了小鼠PCa转移。(A) 对前列腺中K735me1和EZH2的IHC分析；(B) 对8-10个月大小鼠前列腺进行H&E染色，**p < 0.01；(C) 对4个月大前列腺进行IHC染色，**p < 0.01；(D) 对4个月大小鼠淋巴结和肺中AR和CK8进行IHC染色；(E) 对Setd2 KD或者过表达类器官中指定蛋白进行IB分析；(F) 2个月大小鼠在Setd2 KD或者过表达产生类器官成像；(G) 在TMA中依据SETD2分类低表达或者高表达的K735me1或者EZH2；(H) 基于K735me1的表达参数进行Kaplan-Meier复发分析。
6 病人来源SETD2-R1523H突变体不能结合并且甲基化EZH2
研究者猜想人类肿瘤中SETD2的一系列无义突变可能影响其调节EZH2的能力。参考cBioPortal (58,857个患者，21个肿瘤类型中)数据库研究者在包含788个无义突变的2069个肿瘤中鉴定出SETD2突变。在剩余的无义突变中，SETD2酶失活的突变体R1625G最常见（图6A）。有趣的是，SETD2 R1523H突变体主要发生在12个肿瘤中。在一项相关性研究中发现，R1523H被列为3D热点突变，有趣的是，研究者数据表明SETD2的aa 1,520–1,530是其与EZH2直接作用所必需的。因此研究者推测R1523残基可能参与与EZH2的直接相互作用。
在293T细胞中只有过表达R1523H发现与EZH2相互作用的能力丧失（图6C）。SETD2-F2-R1523H突变体，而不是R1625G，不能与EZH2相互作用（图6D）。当在C4-2细胞中异源表达时，SETD2-F2-R1523H并不能降低EZH2和H3K27me3的水平，导致EZH2的多聚泛素化，尽管仍然保留着完整的H3K36me3甲基转移酶的活性（图6E）。正如所期盼的一样，R1625G代表酶失活的突变体，因此并不能减弱EZH2和H3K27me3水平（图6E）。为了进一步证实SETD2-R1523是识别EZH2的关键氨基酸，SETD2-EZH2对接实验证实R1523残基与R78, G79, 以及T80环区形成氢键（图6F）。为了验证这一模型，研究者同时将EZH2的氨基酸78–80残基突变为丙氨酸(EZH2-78-80M)，结果发现其并不能与SETD2-F2结合（图6G），并且对SETD2-F2诱导的降解抵抗。
在肿瘤模型中，SETD2-F2过表达的细胞肿瘤发生能力低于WT细胞。相反，SETD2-F2-R1523H和SETD2-F2-R1625G都不能抑制肿瘤的进展（图6H）。研究者同样利用CRISPR/Cas9技术构建了鼠源Pten不足的类器官细胞，带有SETD2-R1497H突变体。当内源R1497替换为H(Setd2R1497H)，类器官的生长显著加快，并且与EZH2蛋白显著升高以及EZH2靶基因的降低相关。重要的是，Setd2R1497H细胞中EZH2缺失减弱了类器官的生长（图6I）。此外研究者同样在Ezh2 KO或者没有KO的Pten-/-以及Pten-/-; Setd2R1497H细胞中异种移植，并且获得了相似的结果（图6J、6K）。总之，研究者的结果证实人类SETD2中复发R1523H突变体临床相关性的机制。
图6. SETD2-R1523H突变体通过EZH2促进肿瘤的发展。(A) 列表显示SETD2中最显著的无义突变，所有SETD2无义突变肿瘤的数量如图所示；(B) 介导SETD2与EZH2相互作用的区域；(C) 转染指定质粒293T细胞IP的IB分析；(D) GST pull-down实验证实指定蛋白间的相互作用；(E) 稳转指定质粒C4-2细胞的IB分析；(F) EZH2与SETD2潜在的结合界面；(G) 转染指定质粒293T细胞IP的IB分析；(H) 测量指定细胞的肿瘤体积，**p < 0.01；(I) 对有无Ezh2 KD小鼠类器官进行IB分析；(J) 对皮下类器官进行成像和定量，**p < 0.01；(K) 皮下类器官的组织学分析。
7 AMPK-FOXO3轴线刺激了SETD2的水平并且二甲双胍处理抑制EZH2
尽管SETD2突变体导致活性丧失，但不能解释前列腺癌中SETD2的普遍下调。为了发现调控SETD2表达的上游信号，研究者在C4-2细胞中进行了化合物筛选。有趣的是，AICAR、A-769662、2-DG处理能够提高AMPK的活性，提高PCa细胞中SETD2 mRNA水平（图7A）。当AMPKa1/a2缺失时SETD2的表达对AICAR处理并不敏感（图7B）。根据AMPK在能量传感中的作用，葡萄糖剥夺模拟饥饿效应能够刺激SETD2的表达和p-AMPKa。当再次喂养葡萄糖，SETD2的表达以AMPK依赖的方式减弱。研究者接下来拓展了检测，并且发现AMPK特征在转移PCa中下调。这些结果表明SETD2的表达受AMPK正调控。
为了探究AMPK调控SETD2表达的分子机制，研究者构建了SETD2启动子的不同片段驱动的荧光素酶报告基因。包含+360bp至+310bp的片段上坐落着保守的FOXO结合元件，该部位响应AMPK的刺激效应。之前的报道发现AMPK能够提高p-FOXO3促进它的转录活性。同样FOXO3结合位点突变使SETD2启动子活性降低。此外，FOXO3的确占据在SETD2启动子区域，并且AICAR处理后加强。最终研究者说明AMPK信号聚集在FOXO3上刺激 SETD2的表达（图7C）。接下来研究者评估了局部以及转移PCa中SETD2, EZH2, K735me1, p-AMPK或者p-FOXO3的水平。定量结果表明SETD2, K735me1, p-AMPK, 以及p-FOXO3的水平在转移型PCa中广泛降低（图7D）。总之，AMPK以FOXO3依赖的方式调节SETD2的表达。
研究者假设AMPK激动剂二甲双胍能够刺激K735me1，由此影响前列腺癌的发生发展。的确，二甲双胍能够诱导Pten-/-类器官中SETD2的表达，同时降低EZH2和H3K27me3的水平（图7E）。重要的是，Pten-/-; Ezh2K735R中EZH2甲基化的缺失削弱了二甲双胍降低EZH2的能力（图7E）。因此，二甲双胍抑制了Pten-/-克隆形成的能力，但是对Pten-/-; Ezh2K735R或者Pten-/-; Setd2-/-类器官的影响有限。但是二甲双胍处理使H3K27me3的水平以及类器官的大小在Setd2 KO以及Ezh2K735R突变体细胞中减弱（图7E）。研究表明AMPK能够磷酸化EZH2的T311位点，导致PRC2复合体的组装缺陷。同样，2小时二甲双胍处理并不改变SETD2和K735me1的水平，但是EZH2和SUZ12之间的作用减弱。EZH2/SUZ12相互作用在二甲双胍处理24小时后进一步减弱，此时SETD2导致EZH2下调。此外，研究者发现EZH2-K735R; EZH2-T311A双突变中H3K27me3的水平大部分对二甲双胍耐药。总之，这些结果表明AMPK介导的EZH2磷酸化以及SETD2的表达影响了EZH2的活性/水平。这一结果进一步通过类器官原位移植到受体小鼠中证实。二甲双胍处理削弱了Pten不足小鼠肿瘤的生长，但是对PPten-/-; Ezh2K735R或者Pten-/-; Setd2-/-细胞的影响较小（图7F）。为了拓展这一发现，研究者采用发育为CRPC或者转移性肿瘤病人来源的移植体PDXs，并且发现它们对二甲双胍敏感（图7G）。重要的是，二甲双胍处理的PDXs具有较高的SETD2和K735me1水平，而EZH2的水平降低。这些结果表明SETD2-EZH2轴线与代谢能量传感以及肿瘤发生发展相关。
图7. AMPK-FOXO3轴线介导的SETD2表达调节EZH2-K735me1 。(A) 热图显示C4-2细胞经过处理12小时后 SETD2mRNA水平；(B-C) C4-2细胞在有无AMPK KD (B) or FOXO3 KD (C)条件下用1 mM AICAR处理24h进行IB分析；(D) 热图总结在局部和转移肿瘤中指定蛋白之间的关联；(E) 在有无二甲双胍处理7天，2个月大类器官进行IB分析；(F) 对皮下类器官成像和肿瘤体积定量，*p < 0.05, **p < 0.01；(G) 测量二甲双关或者对照每隔2天处理4-6周后的肿瘤体积，*p < 0.05, **p < 0.01。
结论
在本研究中研究者发现SETD2通过其底物EZH2延迟前列腺癌（PCa）转移，SETD2甲基化EZH2，从而促进EZH2降解。SETD2缺失会引起Polycomb抑制的染色质状态，进而使细胞能够获得转移性状。相反，携带无法甲基化的EZH2突变体或者与EZH2结合缺陷的SETD2突变体的小鼠会产生转移性PCa。此外，研究人员发现二甲双胍刺激的AMPK信号会影响FOXO3来刺激SETD2表达。总之，这些结果表明SETD2-EZH2信号轴整合了代谢和表观遗传信号，进而限制PCa的转移。
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