科研 |New Phytologist：水稻缺氮响应的基因调控网络及中心转录因子
编译：Yong-qin，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：Gene regulatory network and its constituent transcription factors that control nitrogen-deficiency responses in rice
译名：水稻缺氮响应的基因调控网络及中心转录因子
期刊：New Phytologist
IF：7.299
发表时间：2020.04
通讯作者：Shuichi Yanagisawa
通讯作者单位：东京大学
DOI号：10.1111/nph.16627
实验设计
实验设计
水稻品种的营养吸收差异
图1 不同水稻品种的营养吸收差异。（a-b）119个水稻品种在氮充足或缺氮条件下的Pi吸收差异的分布图；（c-d）12个水稻品种对胺基和硝酸盐的吸收及其比值差异。
不同水稻品种的基因共表达网络分析
构建基因共表达网络分析后，进一步探索每个基因簇的多个枢纽基因，其中一些编码转录因子，在缺氮响应相关的基因簇中（M1、M3、M5、M9、M11、M15、M16），共鉴定了24个转录因子作为枢纽基因，这些基因都存在与M1, M3或M5基因簇（图4）。这些基因中，Os03g0764600和Os07g0119300编码HRS/NIGT1转录因子，其他基因包括LBD、NAC、MYB、bZIP转录因子，说明这些转录因子在缺氮条件下的植物转录调控和应激反应中发挥重要作用。通过对水稻和拟南芥HRS/NIGT1转录因子的系统发育分析，将Os03g0764600和Os07g0119300分别命名为OsHHO3和OsHHO4。此外，存在几个重要转录因子连接基因簇M1、M3、M5，其中OsHHO3、OsHHO4和OsRLI1（叶片倾角调控因子）连接M1和M3，OsbZIP11和OsLBD38连接M1和M5，这表明这些转录因子在缺氮响应的转录调控尤为重要。
水稻根组织具有独特的细胞组成、生理功能和转录组，本研究试图探索根组织特异表达基因是否集中于共表达基因簇。首先，筛选并确定根组织特异表达的基因群在'日本晴’缺氮条件下为差异表达基因（图5a-b），结果表明缺氮响应基因极少数存在于根分生组织/分生区特异表达基因，多数为根上部的特异表达基因。此外，氮充足的条件下'日本晴’下调的基因主要是根较低部分特异表达的基因，而上调的基因主要是分生组织特异表达的基因。这表明水稻对缺氮响应的转录组变化在根的不同部位是不同的。然后，探究共表达基因簇是否富集于根具体部位的特异表达基因（图5c），结果表明根部中心特异表达的基因富集于基因簇M5，根部中心部位的转运体和通道参与木质部运输和根-茎转运，这表明M5基因簇与营养物质转运和土壤氮含量响应相关。M6基因簇富集于分生组织特异表达基因，不包括缺氮响应基因。M5和M6基因簇中的中心转录因子（RLI1、bZIP11、HDT1）在根不同部位有不同表达模式，且对缺氮条件的响应（表达差异）不同（图5d-e）。
图2 RNA-seq整体表达水平分析。a：95个水稻样品RNA的主成分分析；b：RNA-seq分析流程。
图3 基因共表达网络分析。a：不同氮条件生长的水稻的基因共表达网络，共16个基因簇，且富集于不同功能；b：不同基因簇的表达相似性聚类，柱状图代表每个基因簇的表达模式，数字为基因簇包含的基因数量。
图4 基因共表达网络的中心枢纽基因。
图5 根部特异表达基因与共表达基因簇的相关性。a：根的不同部位分区（Ⅰ分生组织、Ⅱ伸长区、Ⅲ根部较低部位、Ⅳ-a根上部外围、Ⅳ-b根上部中心）；b：根部各个部位的特异表达基因中，缺氮和氮过量响应基因富集的区域；c：根部各个部位的特异表达基因中，共表达基因簇富集的区域；d-e：3个中心转录因子在根不同部位的表达模式和氮响应表达模式。
基因调控网络构建与中心转录因子验证
本研究使用genie3机器学习方法推断转录因子与其它基因的调控关系。结果表明29个转录因子是较重要的候选调控因子（图6a），基因簇M1、M3、M5位于基因调控网络的中心。29个转录因子的下游基因有较多重叠，尤其是OsHHO3、OsHHO4、OsRLI1、OsbZIP11、OsLBD38（图6b）。OsHHO3、OsHHO4、OsRLI1、OsbZIP11之间也存在调控关系，OsNAR2.1（硝酸盐转运蛋白互作蛋白）、OsNRT2.3（硝酸盐高亲和力转运体）、OsGS1;1（谷氨酰胺合成酶）是这些转录因子的共同靶基因，而较特异的靶基因包括Os05g0114400（锌指转录因子）、OsONAC1。
为验证基因调控关系，本研究使用'日本晴’幼苗分离的原生质体进行共转染试验。共转染试验验证了OsbZIP11、OsRLI1、OsHHO3之间的相互调控（图7a），及其相互抑制表达的调控作用（图7b），OsbZIP11、OsRLI1、OsHHO3抑制表达OsNAR2.1，OsNRT2.3被OsbZIP11和OsRLI1抑制表达，OsGS1;1被OsbZIP11抑制表达（图7c）。这表明OsbZIP11、OsRLI1、OsHHO3具有重要的转录抑制功能。OsACTPK1（氮相关蛋白激酶）受M3基因簇的枢纽基因OsNDER1调控，推断的调控网络中受OsbZIP11、OsRLI1、OsHHO3调控（图8a），共转染证明这些转录因子显著影响OsACTPK1表达（图8b）。OsRLI1和OsbZIP11是OsGRX6（谷氧还蛋白）的调控因子，参与氮稳态调控（图8c-d）。这些结果表明氮响应下植物碳水化合物、铁/氮代谢之间具有调控联系。本研究通过CRISPR/Cas9的OsbZIP11&OsbZIP41、OsRLI1基因敲除株系。结果显示关键转录因子在突变株中表达差异（图9a），共同靶基因中OsNAR2.1的表达几乎不受突变的影响，而OsNRT2.3、OsGS1;1、OsACTPK1的表达水平在缺氮条件下的突变体和野生型中存在显著差异（图9b）。因此，突变株的基因表达差异验证了OsbZIP11&OsbZIP41、OsRLI1属重要转录因子。
图6 基因调控网络及重要转录因子，及其共同靶标基因。
图7 OsbZIP11、OsRLI1、OsHHO3、OsHHO4及其共同靶基因的共转染验证。
图8 共转染试验验证OsACTPK1、碳水化合物/铁代谢相关基因的上游转录因子。
图9 CRISPR/Cas9介导的敲除株系的基因表达分析。
讨论
提高作物的氮利用率和氮响应是培育作物十分重要的环节，目前植物缺氮反应中重要的转录因子尚未广泛研究。本研究对氮吸收率差异的20个亚洲水稻品种进行RNA-seq分析，培育于正常与缺氮环境中，经过共表达分析及机器学习构建水稻缺氮响应的基因调控网络。综合试验结果，G2-like和bZIP家族转录因子是水稻缺氮响应的关键转录因子，同时这些关键转录因子受其他基因调控，例如OsbZIP11与OsRLI1之间存在相互抑制关系，导致在rli1和bzip11/41突变株中OsbZIP11和OsRL1表达分别增强。因此，本研究发现的转录因子相互作用和调控途径是对水稻缺氮响应机制研究的基础，对这些关键转录因子的深入分析是未来提高水稻产量的基础。
评论
本研究通过基因共表达分析和基于机器学习的基因调控网络，发现水稻缺氮响应的重要转录因子，揭示了植物缺氮响应背后的调控机制和调控途径之间的联系。根组织是植物吸收周围土壤环境营养的界面，先前研究表明通过研究缺氮环境下的基因表达谱有利于理解植物氮源的内部循环，确定植物总体氮利用率。本研究的共表达基因调控网络和关键转录因子的鉴定更全面地揭示了植物的缺氮响应。
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