基因过表达（gene overexpression）是将目的基因CDS克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用载体骨架上构建的调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。

基因过表达有哪些应用？

研究基因功能

药物靶点筛选

细胞信号传导通路分析

疾病临床诊断

基因治疗

有哪些类型的过表达？

1. 常规蛋白表达常规的蛋白表达的同时可以为蛋白表达添加融合或非融合的荧光标签，亲和标签，亚细胞定位系列等一系列修饰。

2. 非编码RNA表达

与常规蛋白表达不同的是，由于非编码RNA（链接非编码RNA介绍）仅仅转录但不翻译，无蛋白产生，因此此类表达载体（尤其是lncRNA）最好独立表达荧光蛋白，且常规蛋白表达的修饰基本不能使用。目前常见的非编码RNA主要为microRNA、lncRNA、circRNA三大类表达载体与之对应。

3. 毒性蛋白表达

细胞毒性蛋白表达与常规蛋白表达的载体除少量修饰外并无在明显区别，但在AAV载体制备过程中对表达的毒蛋白进行抑制才能产生。此载体主要用于过表达各种对细胞有毒害的蛋白。

可以选择的调控元件有哪些？

实例：载体结构分析：CamKII启动子+ p35基因+自剪切2A肽+非融合GFP绿色荧光标签

基因功能：进行基因功能研究时，如能包含信号通路无疑会提升故事的深度和完整性。研究信号通路很重要的一个手段是过表达基因，观察表型变化。今天就向大家介绍一个过表达基因的技术——过表达载体的构建。下面就从目的基因调取、引物设计、过表达质粒构建详细说明。

以人pyrin基因、pWPI-eGFP过表达质粒为例，构建慢病毒过表达载体pWPI-eGFP-pyrin。

Pyrin基因序列的调取

选择基因亚型，需查阅文献（根据实验需求，并查阅文献发现pyrin亚型1与研究目的一致）

点击NM 000243.2，查找到基因pyrin的CDS区

克隆方法的选择

粘性末端克隆法

该方法需要在目的基因pyrin引物的5’端加上酶切位点，方法如下：

1. 酶切位点选择

2. pyrin基因的引物设计

以PacⅠ与PmeⅠ双酶切为例，pyrin基因的上下游引物为

3. 设计好引物后，PCR扩增pyrin基因，跑胶回收PCR产物，PacⅠ与PmeⅠ双酶切pWPI质粒和pyrin基因，回收酶切产物，连接转化即可。

4.挑取单克隆，验证，获得阳性克隆。

粘性末端克隆获得的重组质粒可用于瞬转，研究基因功能。但是，要长时间稳定过表达基因，就需要慢病毒包装，此时pWPI-eGFP中的cPPT/CTS需要保留，那么PmeⅠ就不适合进行酶切载体。此时就需要另外一种克隆方法——一步法克隆。

一步法克隆法

若进行稳转，后续还需使用该重组质粒包装慢病毒。

1、可通过GFP蛋白的表达情况，观察转染效率。若转染效率较低，可通过抗生素筛选，提高整合基因到基因组的细胞的纯度。因pWPI-eGFP质粒不带有哺乳动物细胞药物筛选基因，因此可以通过流式细胞术筛选，获得带有GFP阳性的细胞，使整合基因到基因组的细胞纯度提高。

2、还可以通过有限稀释法获得单个阳性克隆的细胞，避免在细胞传代过程中，由于细胞不断分裂，过表达的效果不断减弱造成的表型不明显现象的发生。

3、本案例较为特殊，对于其他过表达载体构建或慢病毒包装而言，一步法克隆方法与粘性末端克隆方法或许均可使用。

来源：翌圣生物YEASEN等，直接转自BioMan

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