科研 | Plant Physiol：mRNA-seq和sRNA-seq联合分析玉米热胁迫响应机制（国人作品）
编译：寒江雪，编辑：十九、江舜尧。
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全球变暖所致的高温热胁迫严重阻碍作物的生长发育，导致作物产量急剧下降。目前为止对于植物如何响应高温胁迫的分子机理还不清楚。本研究发现：
1) 营养生长和生殖生长时期不同组织在短时间与长时间高温胁迫下全基因组转录水平的变化有差异。
2) 一个叶绿体来源的19 nt的小RNA在高温胁迫后被显著诱导，它之前被报道为一个五肽重复蛋白的“footprint”，而且叶绿体中光合作用相关的基因表达总体受到高温抑制。
3) 雄穗中转座子来源的24 nt siRNA的丰度在高温胁迫后显著下降，且转座子周围的基因也呈现类似的表达趋势。
该研究对玉米高温胁迫响应全基因组的详细分析为进一步深入研究作物耐热的分子机理提供了丰富的理论资源和参考，其中分析得到的一些热响应调控因子也为玉米耐热性的遗传改良提供了理论支持和筛选靶点。
论文ID
原名：Genome-Wide Transcript and Small RNA Profiling Reveals Transcriptomic Responses to Heat Stress
译名：全基因组转录本和小RNA图谱揭示对热应激的转录反应
期刊：Plant physiology
IF：6.305
发表时间：2019.8
通讯作者：刘琳
通讯作者单位：深圳大学生命与海洋科学学院
DOI号：10.1104/pp.19.00403
实验设计
实验材料：玉米B73分别在热胁迫后2h和48h取其V3时期（第三叶完全展开）的根，茎和叶，和R1（雌穗的花丝开始露出苞叶，即吐丝期）期的叶，雄穗，雌穗和丝。每组至少2个生物学重复，每个重复来自至少5个植株混样，同时完成生理指标的测定。
测序方案：对所取样本进行 mRNA-seq，sRNA-seq及降解组。并通过RT-qPCR和Northern blot进行验证。
结果
1 营养组织和生殖组织对热胁迫的不同的转录反应
对常温下生长的玉米自交系B73在V3期和R1期分别进行了短(2h)或长(48h)的热胁迫(38°C)处理。热胁迫后，V3期玉米新生叶片比对照叶片卷曲，叶片中叶绿素含量下降。在R1期长时间热胁迫后玉米茎秆上出现粘性甜味的液滴，这可能是热应激时分泌的调节渗透压的物质。此外，经I2-KI溶液染色的花粉活力热胁迫后24小时开始下降。这些结果表明，高温胁迫影响了玉米的生长发育。
在热胁迫后0、2和48h(HAH)，在V3时期植株采集叶片、茎和根；在R1时期植株取雄穗，雌穗，丝和叶片分别进行转录组测序，每组至少两个生物学重复（图1A）。热应激处理不影响所分析组织中基因的整体表达模式，但R1-雄穗在48HAH时下降，可能是由于花粉对热胁迫高度敏感所致。与对照组相比，R1时期的DEG数目比V3时期多。V3时期和R1时期共有DEG是2HAH的40个上调基因（图1B），这些DEG主要与热适应，热响应和蛋白质折叠有关（图1C）。这些组织特异性DEG（图1B）GO注释显示光合作用相关基因在2HAH时在R1-雄穗中上调，而在48HAH时下调。与生殖过程、非编码RNA过程和非编码RNA代谢过程相关的基因在R1-雄穗的48HAH表达下调，表明48h的热胁迫影响了花粉活力。在生殖过程中富集的下调基因中有5个基因与其他植物中已报道的雄性不育基因同源。与R1-雄穗相反，在V3-叶片中非编码RNA代谢过程和RNA过程注释基因在48HAH处上调。
热胁迫对生殖生长期的影响大于对营养生长期。研究人员比较了叶片在V3和R1期热胁迫下的分子表达变化，发现在生殖阶段R1-叶片中DEG更多，说明热胁迫对叶在生殖阶段比营养阶段影响更大。而且，营养生长期和生殖生长期叶片的DEG差异也很大，说明热胁迫在营养组织和生殖组织中诱导的不同调控机制提供了依据。
2 热胁迫下玉米叶片中光合作用相关基因的抑制
玉米叶片在38°C以上的温度下净光合作用受到抑制。叶绿体中的基因由两种类型的RNA聚合酶转录：核编码RNA聚合酶(NEP)和质体编码RNA聚合酶PEP。PEP是一种细菌型多亚基酶，其四个核心亚基由RNA聚合酶A(rpoA)、rpoB、rpoC1和rpoC2基因编码，调控光合作用基因的转录。且这四个基因在R1-叶片中的表达水平在2HAH时均显著降低，而在24HAH和48HAH时显著升高（图2A），表现出对热应激的快速适应。由于叶绿体PEP核心酶需要核基因组编码的sigma转录因子来进行启动子识别和基因转录启动，因此也检测了sigma转录因子的表达。在玉米基因组中的7个sigma因子中，只有2个在热胁迫后表达发生了显著变化。对参与光合作用的基因在叶绿体中的表达进行了研究。PSII psbB操纵子具有PEP识别的启动子，在维管植物中高度保守。psbN是psbT和psbH之间psbB基因簇相反链上的另一个基因。根据RT-qPCR结果发现除psbT外的所有基因的表达水平均显著降低（图2B和C）。此外，光合反应中的主要基因在热应激后的特定时间点也都下调（图2D和E）。rbcl编码碳固定反应的第一个关键酶，在热应激后其表达水平也被显著抑制（图2E）。2h热胁迫显著抑制了玉米叶绿体基因组编码的光合作用相关基因在营养期和生殖期的表达，这可能导致热胁迫后营养叶叶绿素含量的降低。除了NEP和两个sigma因子显著变化外，其他由细胞核基因组编码的光合作用相关基因在48HAH时在叶片中的表达略有下降。
图2玉米叶片热胁迫显著抑制叶绿体光合作用相关基因的表达。A四个PEP核心亚基基因在叶绿体中的表达模式。B两个PSII基因在热应激后表达受到抑制。C热应激后psbB操纵子基因表达受到抑制。D psaC在热应激后表达降低。E光合反应中主要基因在热应激后均下调。
3 热胁迫诱导玉米叶片编码PPR蛋白的基因表达
为了更全面地了解玉米对热胁迫的转录反应，研究人员又进行了sRNA测序。在V3-茎、V3-根、R1-雄穗、R1-雌穗和R1-丝组织中的sRNA主要是 22和24nt两种。在V3和R1期叶片中19 nt sRNAs明显富集（图3A）。在48-HAH的R1-叶片中，与对照组相比19nt sRNA的比例显著增加（图3A）。19nt峰是由于psbH基因3’端未翻译区产生的单个sRNA。sRNA序列分析中发现，48HAH时来自psbH的19-nt read的丰度显著增加（图3C），并通过northern blot得到进一步验证（图3D）。19-nt序列正好对应于一种保护psbH 的mRNA不被叶绿体降解的PPR（五肽重复序列）蛋白，HCF152蛋白的结合位点。转录组数据显示HCF152基因在2HAH时被诱导表达（图3E），并通过RT-qPCR得到验证（图3F），而psbH在2HAH时表达降低（图2C）。说明热胁迫引起psbH 的mRNA降解，而HCF152的诱导部分抵消了这一作用。
玉米B73基因组编码至少495个PPR相关蛋白，在48HAH时R1-叶片中有58个PPR基因表达上调，4个下调（图3G）。说明热胁迫可能影响叶绿体和线粒体中PPR蛋白的调节。在58个上调的PPR基因中，一半以上属于P亚家族，其余的属于PLS亚家族的5个亚群（PLS, E1, E2, E1,和DYW，图3G）。
4 玉米雄穗和根中转座子衍生的24-nt siRNA对热胁迫的响应显著降低
从sRNA长度分布可以看出，在V3-根和R1-雄穗中，48HAH的24nt sRNA的丰度比0HAH降低了一半以上（图4A），但在其他组织中没有明显变化（图3A）。24-nt TE衍生的sRNA在48HAH时显著减少(图4C)，通过比对发现减少的24-nt sRNA主要来自TE（转座子）(图4D)。启动子和基因间隔区的sRNA在热应激后也显著减少。在植物中，大多数24-nt的sRNA与DNA甲基化和转录基因沉默相关。研究人员比较了V3-根和R1-雄穗的sRNA在0 HAH和48HAH的丰度。两个组织中，发现下调（48HAH<0HAH）差异sRNA区域（DSR）比上调（48HAH>0HAH）多（图4F）。24-nt下调DSR的分布与玉米染色体上基因分布模式一致（图4F），说明基因近端TE在基因表达调控中的功能。
研究人员分析来自TE的24-nt sRNA的变化与其邻近基因表达变化之间的可能关系，对玉米基因组进行分析以识别邻近基因1kb范围内的TE。在R1-雄穗和V3-根的0、2和48HAH时期对在基因范围1kb内产生24-nt sRNA的TE进行了鉴定。分析表明，在产生24-nt sRNA的TE中有20%-30%的TE在1kb范围内有邻近基因，并且这个比例不受热胁迫的影响（图5A）。TE根据其转录机制被分为两类。根据它们的序列保守性和结构关系，这两种类型的TE可以进一步划分（图5B）。根据基因组分析表明，所有DNA转座子家族和3个反转录转座子家族都定位在邻近基因1kb以内（图5B）。在48HAH的R1-雄穗中产生下调的24-nt sRNA的TE中，只有属于DNA转座子2亚类的Helitron家族在基因附近的1kb富集。这些结果表明，玉米对热胁迫反应的TE在基因附近富集，大部分属于DNA转座子的Helitron家族。
为了进一步分析TE产生24nt下调DSR与其近端基因表达的关系，在R1-雄穗中，48HAH与0HAH比，产生24-nt下调DSR的TE的1 kb范围内的169个基因表达也下调，这些基因在总的下调基因中显著富集响应热胁迫（图5C）。其中，60%TE插在启动子区域，31%插在基因区，高于整个基因组的正态分布（图5D）。这些结果表明，在热胁迫下TE的24-nt sRNA的减少与附近基因的下调有关。
5 不同组织对热应激反应的miRNA表达谱
比较热胁迫和对照样品的表达水平，发现在玉米营养生长期和生殖生长期的不同组织中，miRNA分别在2HAH和48HAH表达有差异。V3组织比R1组织中响应热应激的miRNA多。在V3-叶中几乎所有在2HAH和48HAH差异表达的miRNA都上调，而V3-根和R1-雄穗中差异表达的miRNA在48HAH时大部分表现为下调（图6A和B）。21-nt miRNA的总丰度也呈现出相同的趋势。随机选择miRNA进行Northern blot验证，结果与sRNA-seq分析结果表达模式相似（图6C和D）。
miR1432在R1-叶片48HAH中诱导高表达，而在其他组织中表达量较低（图6D）。热胁迫后V3-根中miR528表达随时间降低（图6C），而miR528*在V3-叶和V3-茎中被胁迫诱导（图7A）。已报道的3个与非生物胁迫反应相关的miRNA，miR398、miR399和miR827在不同组织中有不同的表达模式。miR398在V3和R1时期表达量均较高，而在V3-根和R1-雄穗中表达较低，在48HAH在R1-丝中表达量升高（图6）。miR827在R1期组织中优先表达，在V3-叶和R1-雌穗中被显著诱导（图6）。另一个响应热胁迫的是mi162，它的靶基因是DCL1。在48HAH，mir162在V3-根和R1-雄穗中的表达受到抑制（图6），而V3-根中的DCL1的基因表达升高。
综上所述， miRNA对热胁迫的响应在营养组织比生殖组织更敏感，长时间热胁迫对miRNA表达的影响大于短时间热胁迫，表明玉米对热胁迫的响应是复杂的、动态的。
6 热胁迫改变特定miRNA*在不同组织中的表达
V3-叶片中，几个miRNA*积累达到较高水平，而大多数情况下相应的成熟miRNA没有表现出明显的变化。对热胁迫响应最显著的是miR168*（图7B）。miR168*在V3-叶和V3-根中2HAH被热胁迫诱导表达，但在R1期组织中表达明显下调，并通过Northern blot验证了这些表达模式的改变（图7B），说明miR168*在玉米发育过程中营养生长向生殖生长转变中起着重要作用，并且在两个发育阶段对热胁迫的反应也不同。另一个在热胁迫下表达量显著变化的miRNA*是miR528*。在V3-叶中，miR528*在48HAH的热胁迫下高度诱导，而在V-3茎中，miR528*在2HAH时先下调，后在48HAH时上调（图7A），说明miR528*的组织特异性和动态的响应促进植物对热胁迫的适应。为了确定miRNA*是否有靶点，研究人员在正常条件下对R1-丝进行了降解组测序。发现Zm00001d011589和Zm00001d021605分别是miR168*和miR528*的靶基因（图7C和D）。这两个靶基因与其相应的miRNA*表现出相反的表达模式（图7E和F），表明miR168*和miR528*通过调控其作用靶基因在玉米热胁迫反应中发挥作用。
为了进一步研究差异表达的miRNA和miRNA*在玉米耐热性调控中的潜在作用，研究人员分析了miRNA和它们的目标基因之间表达的相关性（图8）。基于miRNAs与其靶基因表达的得分和负相关系数，选择43个候选靶基因进行GO富集分析，其中5个与类囊体膜组织有关，这与叶绿体的功能有关。这5个基因在V3和R1期叶片中的表达均下调，表明玉米叶片的光合作用受到热胁迫的抑制（图2）。同时通过降解组验证了一些热响应miRNA和miRNA*的靶基因。
讨论
本研究对玉米进行热胁迫2h和48h后，对不同营养和生殖阶段的组织进行mRNA和sRNA测序。鉴定到组织特异性DEG，特别是叶绿体中负责光合作用的基因在短期热胁迫后受到抑制。sRNA分析中发现热应激后显著诱导了一个质体衍生的19-nt sRNA，这可能是一个PPR蛋白的足迹。根和雄穗中由TE产生的24-nt siRNA的丰度在热胁迫后明显降低。邻近基因也表现出类似的下降趋势，表明siRNA及其邻近基因的表达可能是共调控的。最后鉴定了特异的miRNA及在其他物种中没有报道的特异的miRNA*。
评论
本研究在植株进行2小时(短期)或48小时(长期的)热胁迫后，对营养生长和生殖生长不同的组织进行mRNA和sRNA测序。通过比较mRNA-seq与sRNA-seq结果，对玉米不同胁迫时间，营养生长和生殖生长的不同组织类型进行全面动态的研究。得到了热响应mRNA和sRNA的综合表达谱，并从转录和转录后水平阐明了玉米热胁迫调控的分子机制，为玉米耐热性的遗传改良提供了理论支持和候选基因。
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