科研 | 斯坦福大学：单细胞转录组学揭示了记忆B细胞激活、广泛抗流感抗体以及旁位活化
编译：艾奥里亚，编辑：十九、江舜尧。
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抗体记忆可以保护人类免受多种疾病的侵袭。保护性抗体记忆响应需要激活转录程序、细胞增殖以及产生抗原特异性的抗体，但有关这些响应之间是如何协调的尚知之甚少。本研究通过整合单细胞转录、纵向抗体序列测序和抗体结合测定来探究了流感疫苗抗体应答的分子和细胞特征。单细胞转录图谱揭示了一个以CD11c和T-bet表达为特征的记忆B细胞活化程序，该程序与克隆性增殖和向效应功能分化相关。接种疫苗诱导的抗体克隆在亲和成熟过程中迅速与高亲和力血凝素相结合。出乎意料的是，接种疫苗引发的许多抗体克隆并不与疫苗结合，显示流感疫苗接种对抗体的非特异性激活。这些结果揭示了分子识别、转录程序和克隆增殖在人类B细胞记忆回溯过程中是如何协调的。
论文ID
原名：Memory B Cell Activation, Broad Anti-influenza Antibodies, and Bystander Activation Revealed by Single-Cell Transcriptomics
译名：单细胞转录组学揭示了记忆B细胞激活、广泛抗流感抗体以及旁位活化
期刊：Cell Reports
IF：7.815
发表时间：2020年1月
通讯作者：StephenR. Quake
通讯作者单位：斯坦福大学（Stanford University）
DOI号：10.1016/j.celrep.2019.12.063
实验设计
静脉穿刺取血，基于Ficoll梯度法分离外周血单个核细胞(PBMC)，按Stanford人类免疫监测中心/CTRU方案用10%(vol/vol)二甲基亚砜(DMSO)和40%胎牛血清(FBS)冻存。受试者接种了2011-2012年季节性三价流感灭活疫苗。分别于接种前3天、5天(D-3、D-5)、接种前即刻(D0)、接种后1、4、7、9、11天(D1、D4、D7、D9、D11)采血。
结果
1 接种后单个B细胞表型与克隆种群动态的整合
在2012年研究者研究了一名健康青年(18岁)对季节性流感疫苗的抗体谱反应。通过测定疫苗接种时(D0)、接种后1、4、7、9和11天(D1、D4、D7、D9和D11)以及接种前3天和5天(D-3和D-5)的外周血抗体库(Rep-seq)的序列(图1A和1B)，我们评估了疫苗应答期间的B细胞群体动态。从单一B细胞中，共获得了约55,000个克隆中检测到约625,000个特有的抗体重链序列。此外，根据对应于记忆反应的峰值(图1B)，研究者对同一受试者在D7和D9的外周血液样本中纯化的单个B细胞中的抗体重链和轻链转录本进行了测序，共获得94,259个单一B细胞，恰好包含一个重链转录本和一个轻链转录本产物。通过对每一类产生抗体的细胞进行检测，发现其中大多数细胞都可以产生免疫球蛋白(Ig)M抗体。将这些单个B细胞映射到Rep-seq检测到的clones中，以此将单细胞表型与克隆种群动态联系起来。由于多数细胞属于早期B细胞，造成了多数细胞与Rep-seq数据中的clones不匹配的情况，这与转录组图谱所的数据相一致。此外，有研究发现，低丰度记忆B细胞克隆在重复样本中的检出率很低。但在本研究中，对于在这两种测量中检测到的clones的质量表现出高度的一致性（图2A）。
基于克隆种群动态的Rep-seq测量，鉴定了5个疫苗响应的克隆，它们在接种后都显著扩增(从D0到D7的变化>50倍)(图2B和2C)。虽然研究者通过Rep-seq检测到16个疫苗响应的克隆，但由于对保留谱系的采样有限，单细胞测序仅检测到其中5个克隆。尽管如此，这其中有两个克隆在D7样本中峰值最高，但这5个疫苗响应的克隆在D7样本中均>0.1%(范围在0.1%-8%之间，图2B)。疫苗应答克隆中的抗体主要以IgG为主，但在这些克隆存在不同的IgG亚类(其中48%是Ig G1、22%是IgG2，9%是IgG3)。这些结果表明，纵向Rep-seq和单细胞测序的结合捕捉到了整个循环抗体谱尺度上丰富的B细胞群体动态变化，并将单细胞表型（如成对的重轻链抗体序列）与克隆性群体动态联系在一起。
2 疫苗诱导记忆B细胞活化的转录程序
研究者对35,631个细胞进行了单细胞转录组图谱分析，同样对其抗体转录本进行测序的细胞的一个子集也进行了分析。在每个细胞中检测到unique molecular identifiers(UMI)的中位数是2015以及766个基因。在4次技术重复中获得了相似的转录图谱，并统一进行分析。基于T分布随机邻居嵌入(tSNE)可视化分析和DBSCAN聚类，并识别了不同的免疫细胞类型，并基于已建立的类型特定基因进行了手动标注（图3A）。其中三个聚类簇与CD4+、CD8+ T细胞以及巨噬细胞具有一致性，这一结果表明诸如T细胞中的标志物CD3E以及巨噬细胞中的标志物LYS的特异性表达（图3B）。由于分离的B细胞纯度不高，这些细胞类型的丰度较低，因此未进一步分析。根据已建立的标志物和抗体特征，B细胞形成了两个不同的簇，作者将其注释为记忆性B细胞和初始B细胞（NaiveB cell）（图3A）。记忆B细胞表达CD27，并产生主要的分类转换抗体(图3B)，这些抗体主要由体细胞突变产生。初始B细胞表达TCL1A，并且只产生非体细胞突变的Ig M和IgD抗体(图3B)。
通过将单个B细胞转录本映射到基于Rep-seq鉴定到的重链序列克隆上，作者探究了克隆群体动态与转录本状态之间的关系。其中只有记忆B细胞与测序得到的克隆相匹配(图3C)。此外，表现出疫苗响应的细胞具有独特的转录图谱，其特征表现为记忆B细胞簇中转录状态空间的一个小邻域(图3C)。这附近的细胞表达与B细胞激活相关的既定基因相关，包括激活标记CD86和体细胞高突变基因AICDA，也称为AID(图3D和3E)。因此，在这些标记的基础上，将这附近的细胞注释为激活的记忆B细胞，总共有421个细胞(占所有B细胞的1%；占记忆B细胞的2.5%)。
为了确定B细胞状态的转录程序，研究者确定了在初始、记忆以及激活的记忆B细胞中表现出差异表达的基因。其中755个基因在初始B细胞和记忆B细胞之间具有差异(图3D)。其中约一半的基因在初始B细胞中上调，而另一半在记忆B细胞中上调。相比之下，有172个基因在记忆和激活的记忆B细胞之间具表现出差异，所有这些基因在激活的记忆B细胞中均上调。研究者还在激活的记忆B细胞中检测到比记忆B细胞中更多的基因和更多的UMI，这可能反映了由于转录增加而导致的mRNA含量的增加。综上所述，记忆B细胞激活的转录程序主要涉及基因表达的激活而不是去激活。
为了表征激活的记忆B细胞状态，研究者鉴定了6个在激活的记忆B细胞中特异表达的转录因子（TFs）(图3F)。这些TFs包括T-bet（也称为Tbx21）以及ZBTB32（调节小鼠记忆B细胞回忆反应的持续时间）。一些细胞因子受体在激活的记忆B细胞中下调(图3G)。IL4R和IL21R在初始B细胞中高表达，但在记忆和激活的记忆B细胞中表达下调(图3G)，这表明初始B细胞比记忆或激活的记忆B细胞对白细胞介素(IL)-4和IL-21的反应更快。趋化因子受体CXCR4控制进入B细胞成熟的解剖位置，也从初始B细胞逐渐下调到记忆和激活的记忆B细胞(图3G)。其他与体液激活相关的基因在激活的记忆B细胞中上调。趋化因子受体CXCR3作为细胞迁移到炎症部位的必须品，它在激活的记忆B细胞中特异表达(图3G)。总之，这些结果共同定义了与疫苗诱导的克隆扩增相关的记忆B细胞激活的转录程序，该程序具有效应B细胞响应的特征。
3 许多疫苗应答抗体不能与疫苗结合
通过对5个疫苗应答克隆中获得的单个B细胞中的21个抗体进行表达以及功能鉴定，研究者探究了克隆动力学和抗原特异性的关系。基于ELISA测量这些抗体与疫苗(2011-2012年流感季节的三价流感疫苗)的结合发现，只有57%的疫苗反应抗体和40%的疫苗反应抗体克隆表现出与疫苗的结合(图4)。对于未与疫苗结合的抗体，我们进一步进行筛选，同样发现这些并没有相互结合。尽管没有与疫苗或流感蛋白相结合，但剩余的三个克隆在接种疫苗后急剧扩大，并在D7时高度丰富。这表明疫苗以非抗原依赖的方式诱导了一些抗体克隆的激活。
4 疫苗诱导的广谱高亲和力抗流感抗体克隆
为了确定疫苗结合抗体的特异性，基于ELISA方法对它们与纯化的流感蛋白结合进行了筛选。其中一个疫苗应答克隆（命名为L3），显示出与多种血凝素（HA）蛋白的强结合，包括疫苗中包含的甲型流感变种H1 A/California/7/2009和H3 A/Perth/16/2009，以及H5和H9变种(图5A)。这些抗体与已建立的广泛中和抗体MEDI8852和CR9114具有类似的结合强度和广度(图5A)。L3抗体使用IGHV4-34*01和IGHJ3*01基因，并且严重突变(28±5)。通过测定结合亲和力我们发现，大多数L3抗体与H1和H3都有sub-nanomolar级别的亲和力，这两种抗体是取自两个主要的甲型流感病毒组的高度不同的HA变体，只有44%的氨基酸同一性(图5C)。因此，L3以高亲和力广泛结合不同的HA变体。第二个疫苗结合克隆，我们称之为L1，表现出与HA B强烈但微弱的特异性结合。考虑到分离抗流感的广谱中和抗体一直是治疗学和疫苗设计的主要目标，研究者并没有对L1进行进一步分析。
5 广谱结合抗流感抗体克隆的研究进展
为了阐明导致广泛的高亲和力抗流感结合的进化轨迹，作者重建了L3的克隆进化(图5B)。利用最大系统发育模型，又重建了未突变的生殖系前体和四个中间前体，然后表达并测定了它们与不同HAs的结合亲和力。虽然生殖系前体与H1和H3结合较弱，尽管只获得了11个氨基酸取代(6个在重链上，5个在轻链上)，但第一中间前体A1以nanomolar级亲和力与H1和H3结合(图5C)。为了剖析重链和轻链突变对结合亲和力的贡献，我们设计了高亲和力L3N6抗体的变体，其中重链和轻链序列分别恢复到各自的生殖系前体序列中。发现重链的生殖系逆转降低了与H1和H3的结合亲和力，而轻链这种逆转对H1和H3结合的影响最小（图5C）。
因此，L3抗体通过少量的体细胞突变迅速进化出广泛的高亲和力结合到不同的HA变异体上。亲和力的提高主要是通过降低解离率所驱动的。研究发现了亲和力上限的证据：获得超过中间前体A1的突变不会对亲和力产生实质性影响(图5D)。相反，在快速获得高亲和力结合后，L3抗体亲和力明显中性浮动。此外，通过将与H1突变体的结合亲和力与在受试者童年和成年期间进行了比较，发现L3克隆的现有抗体与儿童株(H1 New Caledonia/20/1999)结合的亲和力高于其与成人株(H1 California/07/2009)结合的亲和力（图5E）。这表明，广泛结合的抗HA抗体克隆的亲和力倾向于与儿童暴露相关的抗原变异，支持亲和力成熟最有效地将抗体库集中在早期生活中遇到的抗原上，在随后的反应中留下持久的印记。
讨论
有效的抗体记忆响应的动员需要通过广泛不同的长度和时间尺度来协调，从单细胞中的抗体抗原识别和转录激活到克隆群体动力学，在全方面范围内重塑了生物体的抗体库。免疫系统的这种多尺度特性给理解这一功能带来了挑战。基于单个B细胞测序、纵向抗体谱系测序和抗体功能的生物物理测量等方法，研究者有效的应对这一挑战。研究结果表明，记忆B细胞对疫苗免疫响应具有分子和细胞层面的特点，使人们对免疫记忆的机制有了深入的了解。
最近的研究主要集中在以CD11c和T-bet表达为标志的功能专一化B细胞亚群，称为年龄或自身免疫相关的B细胞(ABCs)。在小鼠和人中，具有这些特征的B细胞与病毒感染、自身免疫和衰老有关。基于单细胞转录和纵向克隆示踪，本研究定义了一种激活的记忆B细胞状态，它显示了效应器B细胞响应的特征，并与之前描述的ABCs有许多共同的特征，这其中包括CD11c、T-bet、FCRL4和CXCR3的高表达。本研究结果表明，这些CD11c+ T-bet+B细胞与疫苗诱导的健康年轻人的克隆性增殖有关。
出乎意料的是，接种疫苗引发的几个抗体克隆并没有与疫苗结合。从形式上讲，不能排除在我们的体外测量中重组疫苗应答抗体与疫苗之间缺乏结合是由于生理条件下发生的构象变化所导致。但研究结果表明，在流感疫苗接种后，具有非疫苗特异性的记忆B细胞的旁位激活是很常见的。先前已在血清抗体和抗体分泌细胞水平上描述了具有非疫苗特异性的记忆B细胞在接种后的多克隆激活。同样，感染麻疹和水痘都会诱导非特异性的B细胞激活。结果显示，大多数由流感疫苗引发的记忆B细胞会产生与疫苗不结合的抗体，这与之前的研究结果相一致。非特异性多克隆激活被认为是维持长期免疫记忆的一种机制，能够使记忆细胞在没有抗原相遇的情况下增殖。此外，旁位激活以一种未知的机制局限于少数克隆，可能与激活的T细胞的定位有关。
研究发现了一个广泛结合的抗HA抗体克隆，在该克隆中，仅重链上不到6个体细胞突变就足以赋予广泛的高亲和力结合，这提供了一个快速亲和力成熟的显著例子。再加上之前通过少量突变出现的流感抗体的例子，这表明单剂疫苗可能足以提供对流感的持久保护。与以前使用重链可变区VH1-69基因的例子不同，L3使用VH4-34基因，它可能是生殖系靶向免疫原的靶点。与许多先前发现的广谱结合的抗HA抗体相比，L3抗体似乎结合了一个不同的表位，这表明这种相互作用的结构特征可能揭示了HA上一个新的脆弱部位。
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