你知道免疫细胞如何发挥治疗作用吗？经过基因工程改造后大有作用
免疫细胞治疗用到的免疫细胞按是否经基因工程改造可分为两大类：未经改造的主要包括调节性T细胞（Treg）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）；经基因工程改造的主要包括嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）、T细胞受体T细胞（TCR）、嵌合抗原受体自然杀伤细胞（CAR-NK）。目前应用最广泛的是经过基因修饰的细胞治疗。
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）
TIL是一种从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，这些淋巴细胞中有部分是针对肿瘤特异性突变抗原的T细胞，是深入到敌军内部打击能力最强的免疫细胞，被认为是一种机体对肿瘤细胞特异性免疫反应。
TIL技术治疗步骤：①得到病人的肿瘤组织块，分离提取活性的TIL细胞→②将TIL细胞在细胞板上克隆化，并加入高浓度的IL-2来选择培养，在三周内产生数十亿TIL→③用患者肿瘤细胞与扩增后的TIL细胞反应，筛选可以杀死肿瘤细胞的效应TIL细胞→④用负载了肿瘤特异性抗原的树突状细胞（DC）进一步扩增培养肿瘤特异性的TIL→⑤患者开始一周的预处理治疗（清髓）以准备接受TIL回输治疗。
TIL细胞治疗的优势：
肿瘤浸润性好，由于本身来自于肿瘤，TIL已经具有合适的趋化因子受体系统，能够在回输后更好地浸润肿瘤组织；
肿瘤特异性好，TIL是非选择的肿瘤特异性杀伤T细胞，靶向多种肿瘤抗原（每份回输TIL平均1.4万个TCR），克服了肿瘤异质性的问题；
安全性好，经过体内选择，绝大多数TIL仅特异性识别肿瘤抗原，而不识别正常组织，因此有着极其出众的安全性。
当然，TIL疗法目前也面临一些挑战。比如：在回输之前，生产人员需要在短时间内将TIL扩增到成千上万倍，这对于工艺的要求是很高的；其次，由于TIL细胞已经天然归巢到肿瘤组织一次，在细胞生命进程上倾向于耗竭，因此，TIL在体外扩增过程中要逆转这种耗竭状态，恢复细胞活力，这同样是极其困难的。
T细胞受体T细胞（TCR-T）
TCR-T是一种过继细胞疗法，即通过筛选和鉴定能够特异性结合靶点抗原的TCR序列，采用基因工程手段将其转入到患者外周血来源的T细胞中(或异源T细胞) ，再将改造后的T细胞回输至患者体内，使其特异性识别和杀伤表达抗原的肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
TCR-T技术治疗步骤：①筛选合适的肿瘤特异性抗原，以及对该抗原具有高度特异性的TCR αβ链序列→②从患者体内分离出T细胞→③将上述能够识别肿瘤特异性抗原的TCR αβ链序列包入病毒基因组，构建病毒载体→④病毒转染T细胞，将目标TCR序列引入T细胞中，获得能够特异性识别肿瘤抗原的TCR-T细胞→⑤TCR-T细胞体外培养，大量扩增→⑥将数量合格的TCR-T细胞输入患者体内，进行治疗。
图片来源：动脉网
TCR-T细胞治疗的优势：
精准靶向性，TCR-T所使用的抗原可以为精挑细选的肿瘤特异性抗原，不受是否表达在细胞表面的限制，可以为细胞内抗原，对肿瘤细胞的精准靶向性更强。
渗透性好，可用于实体瘤，相比CAR-T， TCR-T更容易向实体瘤内部渗透，而CAR-T通常在肿瘤外部附着，不易向内部渗透。
稳定性好，TCR-T引入的是完全人源化的结构不易引起机体的免疫排斥，抗抗体产生的概率低，CAR-T引入的是人为改造的基因，机体对CAR的排斥会更强，可能会缩短CAR-T的存活时间。
然而，TCR-T细胞治疗也存在一定的挑战：首先，目前技术对TCR靶点的选择、亲和力的优化比较困难，另外TCR-T对回输数量的要求也更大，生产工艺有待突破；其次，TCR-T的活化依赖MHC-I类分子将肿瘤抗原呈递给TCR-T，需要共刺激信号等，活化过程比CAR-T困难，肿瘤细胞易逃逸其杀伤；而且由于人群中MHC的多样性，而TCR-T对肿瘤细胞的靶向杀伤需要MHC分子，因此TCR-T疗法无法像CAR-T疗法一样研发出通用型TCR-T，这点限制了TCR-T的使用。
图片来源：Adaptimmune 官网
TCR-T发展经历了四个阶段：
第一代TCR-T是从患者T细胞中分离出肿瘤抗原特异性识别的T细胞亚群，经体外扩增后回输治疗，由于这种T细胞克隆数量极少，个体差异很大，难产业化；
第二代TCR-T是通过克隆上述肿瘤抗原特异性识别的T细胞，获取其TCR基因序列，再转导至患者的外周T细胞上，这种方法使得TCR-T产业化成为可能；
第三代TCR-T通过优化TCR的亲和力，使其能更好地识别肿瘤抗原，再将其转导至患者T细胞上，整体提高TCR-T的成药性；
第四代TCR-T是靶向肿瘤新抗原（neoantigen）的高特异性细胞疗法，肿瘤应答和安全性都大幅提高。
肿瘤的新抗原是肿瘤细胞的体细胞基因突变而产生的肿瘤所特有的抗原蛋白。肿瘤新抗原存在于几乎所有肿瘤中，不同肿瘤差异大，且需要被MHC分子呈递才能利用。
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）
通过对具有免疫球蛋白（Ig）的抗原结合区的T 细胞受体的进行基因改造，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T 细胞，使T细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活。
CAR识别肿瘤抗原后，激活T细胞的免疫通路，相关基因表达上调，分泌颗粒酶、穿孔素等物质直接介导肿瘤细胞溶解，同时也分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ (IFNγ)等炎症因子，招募巨噬细胞等固有免疫细胞杀伤肿瘤组织。
CAR-T不具有MHC限制性，只通过结合靶向抗原即可被活化，从而高效杀伤肿瘤细胞。
图片来源：沙利文分析
CAR-T技术治疗步骤：①构建靶向肿瘤细胞相关表面抗原的CAR分子→②从患者外周血单个核细胞（PBMC）中分选纯化出T细胞→③采用电穿孔、包病毒等方式将提前设计好的CAR分子导入T细胞中→④筛选成功导入CAR分子的CAR-T细胞，并在体外刺激其扩增→⑤将扩增好的CAR-T细胞回输到患者体内→⑥严密监护病人，尤其是控制前几天身体的剧烈反应。
CAR-T细胞治疗的优势：
不受MHC分子限制，杀瘤效果好，CAR分子是人工设计的受体，能够根据目标靶点优化受体结构，CAR-T细胞只需要和靶点分子结合即可被激活，从而杀伤靶细胞，激活过程不受MHC分子，共刺激分子的影响，杀瘤效果好。
抗肿瘤作用持续时间长，CAR-T细胞进入体内后能够在患者体内增殖活化，可长期在体内存活，治疗效果持久，患者输入一次CAR-T细胞，治疗效果可维持数年。患者无需反复注射抗体类药物或化疗，所有年龄人群对CAR-T疗法有良好的耐受。
然而，CAR-T细胞治疗也有一定的不足：首先，CAR-T细胞输入患者体内，容易被阻滞在实体瘤外，不易进入到肿瘤内部，对实体瘤的杀伤效果有限；其次，CAR-T靶向肿瘤相关抗原，并非肿瘤细胞特异性的，正常细胞也可能受到攻击，脱靶效应会产生一定的毒性；而且，引入的CAR受体为外源性分子，具有一定的免疫原性，机体会产生针对CAR的抗抗体，会影响CAR-T细胞的存活，CAR分子使用的scFV不稳定，容易发生自身聚集，引发细胞因子释放综合征（CRS）。
图片来源：沙利文分析
CAR-T细胞疗法自开创以来，已经历过五代技术更迭，代际差异主要在于胞内结构域以及引入的细胞因子和配体。嵌合抗原受体主要由细胞外单链抗体（scFv）、铰链区跨膜区和胞内信号结构域组成。
第一代CAR含有scFv、铰链区、跨膜区及胞内信号域，但没有共刺激域，所以在结合肿瘤细胞抗原后，T细胞增殖数量不够，不能持久作用，不能分泌足够多的细胞因子，对肿瘤细胞的杀伤力不够，最终未能进入市场。
第二代CAR是在第一代的基础上引入了一个共刺激域（CD28或4-1BB），增强了T细胞对活化信号的响应能力，增强了T细胞的作用效果；上市的Kymriah和Yescarta都是第二代CAR-T。
第三代CAR是在第二代的基础上引入了两个共刺激域（CD28和4-1BB），增强了T细胞的增殖和分泌能力，相比于二代CAR-T有着更强、更持久的杀伤力。
第四代CAR是在第三代的基础上引入细胞因子受体结构域或细胞因子基因以及共刺激配体，从而实现更强的T细胞增殖以及杀伤性物质的释放，以收获更强疗效。
第五代CAR即通用型CAR-T，是指从健康志愿者获取T细胞并进行基因编辑敲除相关基因如CAR基因后制成的CAR-T细胞，不需要从患者体内获取T细胞进行定制。
此外，还有其他基于不同目的的新颖CAR也被设计出来，比如针对抗原丢失的双价串联CAR、特异性识别健康组织的抑制性CAR、携带自杀基因以提高安全性的CAR、具有通用潜能的SUPRA拉链式CAR等。
嵌合抗原受体自然杀伤细胞（CAR-NK）
NK细胞即自然杀伤细胞，具有强力杀伤肿瘤细胞的能力，且不具MHC限制性，将NK细胞经过嵌合抗原受体（CAR）基因修饰，赋予NK细胞靶向识别肿瘤细胞的能力，经过体外扩展后注入人体从而达到肿瘤治疗的效果。
NK细胞主要来源于骨髓CD34+淋巴细胞，约占外周血淋巴细胞总数的10%～20%。NK虽然属于固有免疫的免疫细胞，在人体内作用是杀伤病毒感染的细胞和肿瘤细胞。目前临床上使用的NK细胞主要有五种来源：人外周血（PB）、脐带血（UCB）、人胚胎干细胞（hESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）以及NK-92细胞系。
CAR-NK技术治疗步骤：①构建靶向肿瘤细胞相关表面抗原的CAR分子→②从患者外周血单个核细胞（PBMC）中分选纯化出NK细胞→③将提前设计好的CAR分子导入NK细胞中→④筛选成功导入CAR分子的CAR-NK细胞，并在体外刺激其扩增→⑤对扩增后的CAR-NK细胞进行治疗控制→⑥临床输注。
图片来源：恒润达生官网
CAR-NK技术优势：
CAR-NK抗肿瘤谱广，可杀伤实体瘤。虽然实体瘤对非修饰的NK细胞会表现出不同程度的耐受性，但却对抗原依赖型的NK细胞敏感，而且NK细胞本身具有杀伤肿瘤细胞的功能，即使肿瘤细胞下调CAR的靶向抗原，NK细胞依然能够杀伤肿瘤细胞。
安全性高。目前的临床研究显示CAR-NK细胞不会产生GVHD，即使异体NK细胞也不会发生GVHD，同时NK细胞不分泌IL-1，IL6等炎症因子而且NK细胞在体内的持续时间较短，CRS发生风险低。
获取方便，容易制备。由于不会发生GVHD，因此可以直接用iPSC（多功能造血干细胞）诱导或者从血库等地方获取NK细胞，而不需要从患者体内获取，细胞来源广泛，可制成通用型产品，进而降低治疗费用，减少患者等待时间；而且在体外分离和扩增相对简单。
不过，目前CAR-NK细胞治疗也存在一定的挑战：
首先，在缺乏IL-2和IL-15时，CAR-NK细胞在体内存活时间不长，过早死亡的NK细胞治疗效果有限；其次，NK细胞亚群组成复杂，学术界没有研究透彻，用何种NK细胞亚群以达到最好的治疗效果目前是未知的；而且，目前对于CAR-NK的研究局限于临床前和早期临床，对于CAR-NK在人体内使用的安全风险有待进一步研究。
CAR-Macrophage
CAR-Macrophage细胞治疗是基于CAR-T对实体肿瘤疗效不佳而应运而生的一种细胞免疫治疗方式，将特定的CAR基因转染到由多功能造血干细胞iPSC诱导的巨噬细胞内，使巨噬细胞能够特异性的对抗相应的肿瘤细胞。
巨噬细胞作为固有免疫的一份子，本身是不具有特异性的。在将CAR基因转染之后，CAR-M细胞便获得了对抗肿瘤的特异性。
图片来源：Carisma Therapeutics官网
CAR-Macrophage原理：嵌合抗原受体巨噬细胞 (CAR-Ms) 被设计为表达旨在识别肿瘤抗原的CAR→CAR 与肿瘤细胞的特异性抗原结合，介导信号传导，导致肿瘤细胞被巨噬细胞靶向吞噬→吞噬的肿瘤细胞被吞噬细胞内的溶酶体中分解，被处理成肿瘤抗原→肿瘤抗原被巨噬细胞的 MHC 分子呈递→与T细胞表面受体结合进一步激活适应性免疫应答。
然而，巨噬细胞本身就会吞噬细胞和物质，因此如果采用传统的用慢病毒作为载体的基因导入方式就会让转染的效率非常低。目前CAR-M技术的领导企业是由来自宾夕法尼亚大学的CAR-T细胞治疗专家所创建Carisma Therapeutics，已有一款靶向HER-2的产品处于临床1期。
干细胞疗法
干细胞是一种可以自我更新以及分化的细胞，按分化潜能可以分为全能干细胞、多能干细胞以及单能干细胞。基于干细胞的技术广泛应用于临床研究和试验，长期以来造血干细胞移植一直是恶性血液肿瘤患者的主要治疗手段之一。
图片来源：头豹研究院
临床研究和使用的干细胞种类包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胰岛β细胞、成纤维细胞。除此之外，于2006年发现的诱导性多能干细胞被证明可以用于修复小鼠体内视网膜和血管，为其在细胞替代疗法市场中开辟了独特的赛道。
图片来源：沙利文分析
随着近年来基础科研与临床转化的突破，海外已有十余种造血干细胞产品上市，这些产品主要获批在欧洲，美国及日韩。在中国，造血干细胞（HSC）和造血祖细胞（HPC）被排除在细胞制品类药品范围之外。
截至2021年6月，中国尚未批准任何干细胞医疗技术或干细胞药物临床应用。但从临床转化看，中国累计已有11款间充质干细胞新药申请获得临床批件，适应症包括移植物抗宿主病、炎症性肠病、类风湿关节炎、缺血性脑卒中、糖尿病足等。从国家到地方政府都在积极推进干细胞临床应用及产品转化进程。现今，进展最快干细胞治疗项目处于临床III期，适应症为异基因造血干细胞移植后巨细胞病毒（CMV）感染（成都蓉生）。
图片来源：头豹研究院
市场空间
根据沙利文分析报告，细胞治疗行业发展从传统细胞治疗向与基因疗法相结合发展的趋势，细胞的编辑改造离不开基因工程技术的发展，全球细胞和基因治疗（CGT）行业市场规模自2016年开始飞速增长，中国CGT行业市场规模在政策利好及研发投入增长的背景下也将快速扩增。
2016年至2020年，全球细胞和基因治疗（CGT）市场从0.5亿美元增长到20.8亿美元，复合年增长率为153%。预测未来CGT市场规模仍保持快速增长趋势，于2025年全球整体市场规模为305.4亿美元，2020到2025年（估计）全球CGT市场复合年增长率为71%。
2016年至2020年，中国CGT市场从0.02亿美元增长到0.03亿美元，复合年增长率为12%。预测未来中国CGT市场规模仍保持快速增长趋势，于2025年整体市场规模为25.9亿美元，2020到2025年（估计）中国CGT市场复合年增长率为276%。
图片来源：沙利文分析
CAR-T细胞疗法作为近年来热点研发领域已为恶性血液肿瘤患者带来了希望，市场规模持续稳定增长，未来市场潜力巨大。
根据弗若斯特沙利文的数据，全球CAR-T细胞治疗市场从2017年的0.1亿美元增长到2019年的7亿美元和2020年的11亿美元，预计未来几年将加速增长，2024年将扩大至66亿美元，2019年至2024年复合年增长率为55.0%。预计2030年市场将进一步增长至218亿美元，2024年至2030年复合年增长率为22.1%。
图片来源：兴业证券
小编在本文中分析了细胞行业分类、技术优缺点、行业发展情况以及市场空间，由于篇幅限制，仅限于基础知识，小编将在后续推文中详细分析每个细胞治疗细分类型的市场痛点和在研公司，敬请期待！
参考资料：
【1】弗若斯特沙利文-2021年中国细胞与基因治疗产业发展白皮书
【2】兴业证券-细胞治疗，七载归来方始坼：细胞治疗/CAR-T行业深度报告
【3】东吴证券-千呼万唤始出来，犹抱琵琶半遮面：中国细胞治疗产业研究(一)
【4】The clinical pipeline for cancer cell therapies. Nat Rev Drug Discov. 2021 Jul;20(7):503-504
【5】各公司官网
注：本文旨在介绍医药健康行业研究进展，不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
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