酶联免疫吸附实验常见问题分析

Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色

溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。

标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。

Q2.标曲和样本均不显色

在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。

推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

Q3.标曲显色，样本不显色

当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。

对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大

这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。

Q5.本底偏高，样本值测不到

标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。

在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。

Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大

有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后，计算得到的样本值之间差异较大，应该选择哪一个稀释倍数呢？

这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时，血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触，基质效应较明显。而经过稀释后，干扰因素也随之稀释，影响就会较小。当某两个梯度稀释后，计算得到的样本值接近时，我们就可以认为在该稀释梯度时，样本中的干扰因素影响较小，计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本，经过多倍稀释后，就更加测不到了，此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。

Q7.不同试剂盒中的组分能否通用

除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液，其它组分不建议用其它试剂盒的组分，甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的，如果贸然使用其它试剂盒的组分，有可能对结果产生影响。