柿子基因组测序与其性别决定系统的进化分析
写在前面
前日，课题组每周小组会时排到我分享论文与研究进展。我大体看了下近期植物小RNA相关研究报道时，发现bioRxiv上，日本Takashi课题组上传了其所开展的柿子基因组测序文章。大体扫了一下，我便在课题组组会上分享。文章题目为《The persimmon genome reveals clues to the evolution of a lineage-specific sex determination system in plants》，文章主题有二：
公布柿子基因组测序结果
阐述柿子性别决定系统的进化
研究相关背景
二倍体柿子雌雄异株。
Takashi组早在2014年，即在science上发表了柿子性别决定基因的定位与功能鉴定。该报道主要内容为
通过基因定位，确定了柿子上MeGI基因（HB转录因子）表达抑制雄蕊发育，辞成雌花；柿子Y染色体上存在一个MeGI序列高度相似的非编码基因OGI，该基因可转录并形成发夹结构，产生小RNA并靶向MeGI，从而接触MeGI对雄蕊的抑制，最终促成雄花。
大体逻辑即：
雌株：MeGI --| Male
雄株：OGI --| MeGI --| Male, 亦即 OGI --> Male
该工作发表两年后，即2016年，Takashi组在The Plant Cell上发表了六倍体柿子性别决定相关论文。在转录调控（MeGI）和转录后调控（OGI）两个层次上，增加一个新的层次，即表观调控（甲基化）。其发现，六倍体柿子的雄性株常常出现雌花。并通过系列分析与测序，确定是Y染色体的OGI启动子区间插入了一个Kali转座子元件。其甲基化程度的变化，影响了OGI的功能实现。
柿子基因组的测定
二倍体柿子和六倍体柿子的花性决定系统存在多样化，但调控的核心是没有变化的，即MeGI。Takashi组常年以柿树为材料，故其开展了该物种的基因组测定工作。
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其通过PacBio测序，得到contigs，随后基于F1代简化基因组测序构建的遗传图谱，挂成15条假染色体。整体上得到单倍型大小约1G的柿子基因组序列。从Circos图来看，还是挺好看的。【注：简单Circos图绘制，欢迎使用我们课题组开发的TBtools】
鉴定了柿子独立的全基因组复制事件（WGD）
作者开展物种内同源基因的ks值计算并绘图。分别比较了葡萄，猕猴桃，番茄和柿子的ks值分布图。【注：批量ks计算，一般直接简单粗暴地使用NG法，欢迎使用我们课题组开发的TBtools】
左图中可以看出葡萄对应的双子叶植物的古六倍化事件。番茄对应的茄科三倍化。猕猴桃独立的两次WGD事件。柿子也存在近期独立的二倍化事件。右图，作者绘制了4Dtv的分布，进一步说明。
确定柿子WGD事件发生的时间
作者通过绘制柿子内部，柿子与猕猴桃，柿子与葡萄之间的ks值分布。基本确定柿子的WGD时间发生在其与猕猴桃分化之后。
同时，其也基于ks值做了分化时间推断，如右图。
很巧的是，作者提出，柿子的WGD时间恰恰就发生在K-pg时期。
K-pg时期是很有趣的一个时期。不了解的人听到这个或许都会觉得有趣。K-pg时期，即恐龙大灭绝的时期。该时期也发现了大量植物WGD事件。
WGD产生的基因功能分析
基因复制，为基因突变提供了原料。基因突变，往往带来新的基因功能。作者对WGD产生的大量基因进行了dn/ds计算，同时也做正选择分析。
从左图看出，与预期相似，仅有极少数基因存在正选择（dn/ds>>1）【注：批量dn/ds计算，一般直接简单粗暴地使用NG法，欢迎使用我们课题组开发的TBtools】。从右图，作者使用PAML软件做了分支选择压力分析，并发现WGD产生的基因中，仅有一个拷贝受到显著正选择【注：开展正选择分析，调用的是codeML，新手使用难度大，欢迎使用Raindy与我一起开发的EasyCodeML，界面化操作，免除使用烦恼了和模型参数困扰】。
有趣的是，作者同时发现，在少数几个收到强烈正选择的基因中，赫然出现MeGI (即，其在2014年与2016年发现的柿子性别决定系统的关键基因)
MeGI与其同源基因的功能分析
如上，作者发现了MeGI在柿子中存在一个姐妹基因，如下，MeGI与SiMeGI（Sister MeGI）
MeGI即HB转录因子家族，其构建进化树，并确定了MeGI和SiMeGi的近缘或说复制关系。事实上，MeGI在大麦中的同源基因为Vist，该基因控制的是花器官的发育，与性别分化没有关系。
于是，作者提出了猜想：
SiMeGI执行的仍然是Vist的功能，而WGD之后柿子获得了神奇MeGI，并演化出新的功能，促成其雌雄分化。
MeGI与SiMeGI受到不同的选择压
与上述方法相似，作者获取了多个柿属物种的MeGI和SiMeGI，并开展了选择压力分析【注：欢迎使用EasyCodeML】
其发现，MeGI分支相对于SiMeGI和其他物种的HB同源基因分子，受到了显著正选择（功能获得）。同时，在MeGI和SiMeGI分化后，两者均处于纯化选择（功能固定化）。
随后，作者开始了神级操作。对MeGI系列同源基因，进行滑窗dn/ds计算。【注：Ziheng Yang，即PAML作者不推荐这个操作，具体有发表相关学术论文】
Anyway，作者通过滑窗分析，发现MeGI分支的5端受到强烈的正选择，而其他区域，尤其是HB域（即结合域）并没有明显变化。
其在进一步比较MeGI和SiMeGI两个分子内部的滑窗Dn/Ds分布，发现，MeGI受到了正选择的区域（5端），在于SiMeGI分化后，受到强烈的纯化选择。
MeGI与SiMeGI的基因功能验证
纸上得来终觉浅，分析的结果往往还是不足以说服别人。作者将MeGI和SiMeGI分别在烟草中进行超表达，并观察表型。
表型无需解释，超表达的MeGI直接影响了雄蕊发育，从b和e子图可看出，花粉萌发率差别显著。此外，植株长势也有不同。（MeGI毕竟是转录因子，在柿子中主要是花性别决定时表达且作用）
作者对柿子雌雄花在不同发育阶段的表达进行定量分析，也发现，只有在雌花中MeGI表达与SiMeGI有不同的峰。
此外，MeGI事实上是通过调控PI基因实现功能，于是我们也可以看到SiMeGI并不影响PI表达。
作者通过DAP-seq，证明了，MeGI的结合功能确实没有变化，与其他HB相同。（进一步说明，5端的变化，是其新功能获得的关键）。
一图阐述柿属性别决定系统的进化
柿子祖先在分化出来之后，仅仅有SiMeGI。其经历一次WGD后，获得MeGI。MeGI获得新功能，抑制雄蕊，促成雌花。在随后的一次反向复制后，产生OGI，抑制MeGI功能，解除雄花抑制，促成雄花。
写在最后
前天在bioRxiv中上传的文章。整体上看起来是非常不错的工作。也说明了一些问题。从文章使用的分析策略和手段来说，并没有新的技术。甚至使用了Tophat等相对较老的软件（该软件作者一度发表声明，希望大家不要再用）。此外，大部分进化分析使用的是Mega，少数涉及PAML等。总的来说，作者似乎也与其他课题组开展了合作。这是不错的操作。
文章所阐述的发现较好，转基因实验也说明了基因的功能。Bingo!相信将会发表在不错的期刊上。
植物的性别决定是一个非常有趣的研究方向。在植物界，仅有约5%的植物是雌雄异株，还有5%左右是雌雄异花同株。这样占比较小的情况并没有局限在某个进化分支，而是遍布于不同的科甚至是科下面的部分属。
性别的分化，主要目的，事实是实现杂交，或者说增加物种的多样性。但是杂交本身是一个相对耗费能量的事情。一个物种要快速繁衍，比如拟南芥，自交下一代自交下一代自交下一代，当然就很快。只是无限的自交便失去多样性。有利有弊。或许，性别分化的出现，确实主要还是应为复杂环境变化的一个解吧。
主要参考文献