解决内外源病毒污染，你必须了解的清除灭活病毒验证及解决方案

生物制品生产原辅材料通常为生物源的（如微生物、细胞、动物或人源的组织和体液等），具有潜在内外源病毒污染的风险。因此国内外的相关法规要求生物制品在生产过程中应包含至少一步或者多步具备灭活/清除病毒能力的工艺步骤，而且要对这些步骤的病毒灭活/清除能力进行验证。理想情况下，病毒被添加到具有代表性的生产样品中（该样品与生产过程样品有相同的浓度、缓冲体系和生产历史等），以评估产品生产工艺清除\灭活已知和未知病毒的能力，法规要求至少达到4Lg的LRV值才是有效的清除灭活步骤。

污染来源及模式病毒

细胞系被认为是病毒污染的关键来源，细胞库（主细胞库[MCB]和工作细胞库[WCB]）在用于临床生产之前需进行了广泛而细致的检测，以证明没有病毒污染，ICH Q5A详细介绍了细胞系鉴定检测指南。

清除/灭活病毒验证的目的是评估生产工艺清除/灭活已知病毒的能力，并通过表征其清除/灭活 “模型”病毒的能力来估计。病毒清除/灭活验证选择模型病毒的因素包括病毒滴度、病毒滴度检测方法以及病毒可能对研究人员造成的健康危害。

通常用于病毒清除/灭活验证的小鼠或仓鼠细胞系小鼠逆转录病毒模型是异嗜性小鼠白血病病毒（X-MuLV）和鼠细小病毒（MMV），MMV是一种小型的非包膜病毒，由于低pH条件不能使其失活，因此通常更难清除。

在新药IND申请阶段，需要对至少两种模型病毒进行病毒清除/灭活验证研究，通常选择一种模式逆转录病毒（X-MuLV）和一种细小病毒（MMV）。在BLA申请阶段，通常使用至少3-5种模型病毒进行病毒清除/灭活研究。下表为一组在新药Phase III阶段鼠细胞系衍生产品病毒清除/灭活研究中模型病毒。

清除/灭活病毒工艺

过滤

生物制品生产过程中，过滤是一个关键的除病毒步骤，虽然过滤已被证明对较大的病毒颗粒有可靠的去除效果，但去除尺寸很小的病毒（如细小病毒）的效果较差。Miesegaes等人总结了除病毒过滤的数据、工艺操作范围和减压对除病毒过滤的影响。在除病毒过滤加标研究中，病毒原液的质量对病毒去除过滤器的性能有重大影响。高纯度的病毒储备溶液可确保病毒过滤器不会因来自加标病毒的微粒而堵塞，并导致过滤膜蛋白质载量显著提升。

pH

众所周知，低pH条件可以成功地灭活包膜病毒，这与单克隆抗体（mAb）下游纯化工艺非常兼容，Protein A捕获柱通常在低pH下洗脱，洗脱之后是低pH孵育步骤，以灭活病毒。

病毒灭活步骤通常在pH3.0和4.0之间进行，已经证明，稳定的病毒灭活需要3.8或更低的pH值。在pH值为3.8或以下时，病毒灭活非常迅速，通常在10-15分钟内完成。对于低pH值灭活需建立灭活动力学曲线。

有机溶剂/表面活性剂

对于一些不能耐受低pH的产品，通常使用有机溶剂/表面活性剂（S/D）作为灭活包膜逆转录病毒的方法。S/D是处理血液制品的主要方法之一，也常用于灭活重组蛋白产品中的包膜病毒，特别是当产品不能耐受低pH。常用的灭活条件是0.3% TNBP和1%吐温-80，24℃处理至少6h；0.3%TNBP和1%Triton X-100，24℃处理至少4小时。S/D处理前应先用1um滤器除去蛋白溶液中可能存在的颗粒（颗粒可能藏匿病毒从而影响病毒灭活效果)。加入S/D后应确保是均一的混合物。在灭活病毒全过程中应将温度控制在规定的范围内。

色谱层析

常用的除病毒色谱层析方法有亲和层析（如Protein A）和离子交换层析。

Protein A亲和层析为单克隆抗体和Fc融合蛋白提供了高度的选择性，并被广泛用于它们的纯化。Protein A亲和层析通常可以达到4-5个LRV的逆转录病毒清除率；

阴离子交换色谱法是一种强大的逆转录病毒清除方法。在适当的条件下，该步骤还可以提供>4 LRV。因此，这是一个首选的病毒清除步骤，特别是对于单抗这种典型的碱性蛋白质，可以通过阴离子层析纯化及去除病毒。阳离子交换和疏水层析已被证明具有相对较低的LRV。根据工艺条件，通常可获得1-3个对数的LRV。

其他

A．巴氏消毒法：对于有一定热稳定性的产品，可采用巴氏消毒法，巴氏消毒法可快杀灭速伪狂犬病病毒(PRV)，Sindbis病毒和HIV-1等病毒；经实践证明白蛋白的巴氏消毒法对HIV和肝炎病毒是安全的，其病毒灭活条件已经很完善。

B．干热法：80℃加热72h，可以灭活HBV、HCV、HIV及AV等病毒，但应考虑制品的水分含量、制剂组成（如糖、蛋白、盐分等）对病毒灭活效果的影响。病毒灭活用的干热箱至少每半年验证一次。

清除/灭活毒方案设计

✦除/灭病毒验证研究应符合GLP的要求；

✦研究影响去除/灭活病毒效果的参数允许变化的幅度；

✦研究病毒灭活动力学，包括病毒灭活速率和灭活曲线；

✦指示病毒滴度应尽可能高（病毒滴度应≥10^6/ml）;

如可能，验证过程中每步取出的样品应尽快直接检测病毒滴度，不做进一步处理（如超离心、透析或保存等），如样品必须做进一步处理，或不同时间取出的样品要在同一时间内进行测定，应考虑这些处理对病毒滴度检测结果的影响。

病毒滴度检测方法 

常用的病毒滴度检测方法包括蚀斑法、TCID₅₀及Q-PCR法等方法。

蚀斑法和TCID₅₀法适用于感染并产生致病变效应的病毒的滴度测定，多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应(cytopathic effect，CPE)，可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色识别和判断。

荧光定量PCR（qPCR）可以将DNA序列的一段特定区域进行数量级扩增，因此是一种极其灵敏的检测方法，广泛应用于病毒的定性定量分析。该方法具有快速、特异、灵敏等、稳定性好（≤15%）优点。

解决方案

浙江恒驭生物科技有限公司（简称：恒驭生物）是一家由顶尖科研团队创立，致力于为全球创新药企提供生物检测及相关工艺验证、开发服务及产品的综合供应商。

恒驭生物依托国内多地的BSL-2级实验平台、符合ISO9001、CNAS及GLP要求下的质量体系，为客户药物开发及上市生产阶段提供有保障的生物安全性检测服务，现阶段已覆盖病毒清除灭活工艺研究、细胞株/库检定、原材料检测服务。

在病毒清除/灭活试验平台方面，恒驭生物拥有P2认证实验室平台、HyPure系列高滴度高纯度病毒；在清除/灭活病毒验证方法方面，恒驭生物可根据客户需要对全部法规接受的主要方法进行去病毒工艺验证，覆盖生物制品（血液制品、真核细胞表达产品，如抗体、重组蛋白）、生化药品（动物来源）及II、III类医疗器械产品。

在模式病毒方面，药典示例常用指示病毒全覆盖，并具备完善的细胞库检测服务（包括支原体、内外源病毒因子、致瘤性、成瘤性及染色体检测），在病毒滴度检测方法方面，建立了齐全的（如TCID₅₀、qPCR等）病毒滴度定量检测方法。

国产新药研发昼夜兼程，对于药品“质量及安全”的研究与关注，是永恒的使命。基于此，由恒驭生物联合佰傲谷BioValley举办的“GO H-Quality生物制药安全及质量守护者”高端闭门系列沙龙活动之苏州站将于2021年7月31日在苏州金鸡湖凯宾斯基大酒店举办。本次活动特邀多位行业大咖齐聚一堂，通过轻松开放的氛围，致力于打造一个深刻精致、深度交流的平台，共同助力推动中国生物医药质量安全的发展。诚邀您莅临本次盛会！

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活动流程安排 

12:30-13:00 嘉宾签到

13:00-13:05 开场介绍

13:05-13:40                   

主题：实现高效病毒清除的下游工艺开发控制策略

嘉宾：汪才坤 康日百奥 下游研发负责人

13:40-14:20

主题：生物蛋白药的表征

嘉宾：史力 怡道生物 董事长

14:20-14:50   茶歇

14:50-15:30

主题：生物制品生产中病毒清除验证策略

嘉宾：朱向莹 恒驭生物 CEO

15:30-16:10

主题：临床研究质量管理体系简介

嘉宾：蒋燕敏 和铂医药 质量部负责人

16:10-17:00  圆桌讨论

﹡中国规模和创新速度对全球生物制药价值链的影响 

﹡国外内生物药在 R&D、药品质量和人才培养的差距和展望 

﹡回首制药生涯，走过的“坎”和“幸”   

主持人：朱向莹 恒驭生物 CEO

讨论嘉宾：

史   力   怡道生物 董事长

秦   刚   启德医药 董事长（TBD）

蒋燕敏   和铂医药 质量部负责人

郭树华   普乐康医药 董事长

17:00-17:30

全体与会嘉宾合影

17:30

 当日活动结束~

参考文献

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