【LorMe成果】根际原生动物群落是决定植物健康的关键因素

3月3日，LorMe实验室在根际微生态与植物健康研究取得进展，成果以“Rhizosphere protists are key determinants of plant health”为题发表在国际著名学术期刊《Microbiome》（IF₂₀₁₈=10.465）。该成果揭示根际原生动物群落及其与细菌群落的互作在保护作物健康方面发挥重要作用。

背景介绍

在自然条件下，植物与土壤微生物之间联系紧密，在根土交界面根际蕴含着大量的微生物，它们对植物生长和健康有重要影响。土传病原菌一般从根系入侵植物，然而在进入根内之前，必须要突破根际土壤微生物组成的生物屏障，因此土壤微生物群落在抵御病原菌入侵植物根系中发挥重要作用。土壤微生物包括细菌、真菌、原生动物和病毒等微小生物，它们在根际形成复杂的生物互作网络，对作物的生长和健康有重要的影响。但对于根际原生动物对植物健康的影响目前还并未受到重视。原生动物及其与其他微生物的相互作用在植物生长发育的整个过程中会发生变化，但针对微生物组的分析通常仅在植物成熟时或已发生病害后进行单次研究，很难将植物健康与微生物群落潜在特征进行关联。此外，与细菌和真菌相比，其他微生物例如原生动物群落，因其对环境输入的响应更强烈，并且各季节间组成变化更大，可能是预测植物健康更佳的指标。

土传青枯病是一种毁灭性的细菌性病害，在世界范围内，尤其是中国危害极大。青枯菌（Ralstonia solanacearum）是其致病菌，在土壤中存活能力强，一般从根系侵染植物，难以防控。前期研究发现田间番茄土传青枯病的发生与根际细菌群落结构和功能特性密切相关(Wei et al., 2019,Science Advances)。在本研究中我们通过非破坏性根际土壤样品连续采集装置，综合分析了细菌、真菌和原生生物在内的整体根际微生物组以及微生物功能相关的代谢基因，探究在植物整个生长周期中这些群落和功能基因与土传青枯病发生的关系。

实验设计

利用非破坏性连续采样根盒装置（如图1），每棵番茄苗独立种在装有均质连作番茄的土壤根盒中。移植番茄前，从中间采样层的内侧和外侧收集三份土壤样品，将其均质化后合并。这些土壤样品视为初始土壤样品（第0周）。在移植番茄后的第3、4、5、6周，分别按照上述方法对每个根盒进行采样。对最终表现枯萎症状且可检测出青枯菌的番茄（定义为发病植株）与未表现出枯萎症状且未检测出青枯菌的番茄（健康植株）土壤样品进行DNA提取，以此为依据对健康和发病番茄植株在整个生长过程中根际细菌群落、真核生物群落及功能基因进行分析。

图1  根际土连续采集装置示意图（A）和田间试验设计（B）

装置由三层圆筒组成，底面直径110 mm，高136 mm。三层结构中，外层是4 mm金属圆筒起支撑作用，内层（根室）是由孔径50 µm尼龙网制成的圆筒能够限制植物根系的生长，中层由若干孔径150 µm的尼龙网袋组合而成，内装厚度2 mm的混匀田间土壤。因中层网袋中的土壤受根室内植物根系的直接影响，所以将其视作根际土。每个采样时期采集位置相对的3个尼龙网袋。

结果与讨论

1 根际原生动物群落结构是预测植物健康的关键因子

在健康与发病番茄植株中，根际原生动物群落结构是预测青枯菌数量的最佳因子（图2 a）。同时在健康植株中，细菌群落的多样性和群落结构可以显著预测青枯菌数量（图2 b），这与我们在之前的研究中发现苗期根际土壤细菌群落结构和功能决定作物未来健康（Wei et al., 2019, Science Advances）一致。在发病植株中，根际原生动物的群落结构是预测青枯菌数量的最佳因子（图2 c）。

图2  健康与发病植株（a），健康植株（b）及发病植株（c）中主要微生物参数在植株整个生长过程中对预测青枯菌密度的相对重要性

2 吞噬型原生动物可以调控植株生长过程中病原菌的生长

我们发现健康与发病植株初始根际细菌群落有差异，而真菌与原生动物群落并无显著差异。但按照原生动物功能分类群进行分析时，我们发现初始阶段吞噬型原生动物群落结构可以指示植物最终健康状态（图3 a, b），因为随着植株生长，该差异可以指示健康与发病植株。指示性分析显示，初始阶段健康植株中13个原生动物OTU对于植株健康有指示作用，其中七个OTU属于吞噬型原生动物（图3 c）。共发生网络分析显示，在初始阶段相比于发病植株，健康植株中具有更多与青枯菌负相关的原生动物OTU（图3 d）。综上所述，我们认为吞噬型原生动物以及初始阶段的特定分类群可以预测植株成熟后的病原菌数量与植物健康状态。在对发病植株进行单独分析以及将健康与发病植株整合分析后，我们发现在植株生长过程中，吞噬型原生动物相对丰度与青枯菌数量显著负相关（图3 e）。此外，在发病植株中，吞噬型原生动物的相对丰度随着植物生长而显著降低（图4），而这一降低与青枯病的爆发相吻合，因此我们进一步推测吞噬型原生动物可以控制植株生长过程中病原菌的生长。

图3  原生动物系统分类及功能组群落结构在起始阶段（第0周）健康与发病植株间的差异（a）；起始阶段健康与发病植株中的吞噬型原生动物（b）和指示性原生动物OTU（c）的群落结构，以及与青枯菌具有直接相关性的原生动物OTU功能组网络（d）；健康与发病植株生长过程中，吞噬型原生动物的相对丰度与青枯菌的相关性（e）

图4  健康与发病植株中吞噬型原生动物的相对丰度与植物生长周期间的相关性

3 根际原生动物自上而下的调控影响植株健康状态

对番茄生长过程中功能基因的变化进行分析，发现健康植株中与碳水化合物与辅酶代谢相关基因的相对丰度在苗期显著高于发病植株（图5 d, e）；到了第五周（青枯病爆发期，图6 e），健康植株中的大多数代谢基因的相对丰度显著高于发病植株（图5）。在八种代谢基因分类群中，次生代谢产物合成（Q）基因与青枯菌数量显著相关（图6 a）。在健康植株中，Q基因的相对丰度随着时间推移而增加，在第0、3、4周时，健康与发病植株中Q基因无显著差异（图5 h），第五周时其相对丰度显著高于发病植株（图6 b）。同时第五周时吞噬型原生动物相对丰度更高的健康植株中（图6 c），Q基因及芽孢杆菌的相对丰度也更高（图6 b, d），从而导致青枯菌数量降低（图6 e）。此外，在整个植株生长过程中原生动物OTU、细菌OTU及Q基因的共发生网络显示，健康植株中原生动物与细菌和功能基因的相关性高于发病植株（图6 f）。尤其是Pro_OTU105在初始阶段与青枯菌呈负相关，在植株生长过程中，与六个细菌OTU呈负相关，其中一个是与非核糖体肽合成酶基因（COG1020）呈正相关的Bac_OTU17，该基因是抑制青枯病的关键基因之一（图6 f）。此外，健康植株的吞噬型原生动物OTU数量、细菌OTU数量及Q基因的数量相比发病植株更多，网络更为复杂。值得注意的是，共发生网络中的特定连接仅仅提供了潜在的相互作用信息，但是进一步验证其中的相互作用机理，需要特定的共培养实验，这也是我们现在研究的方向。但是，网络结构特征和组成还可以指示系统稳定性和生态功能的，比如健康植物得益于更复杂的网络的存在，其中包括更多的吞噬型原生动物（高营养水平的微生物）。

图5  植物生长发育过程中，健康与发病植株中八个代谢基因和总代谢基因的相对丰度

[C]能量产生和转化（a），[E]氨基酸运输和代谢（b），[F]核苷酸运输和代谢（c），[G]碳水化合物运输和代谢（d），[H]辅酶运输和代谢（e），[I]脂质转运和代谢（f），[P]无机离子转运和代谢（g），[Q]次生代谢产物的合成、转运和分解代谢（h）和总代谢基因（i）

图6  健康与发病植株中八种代谢基因组预测生长过程中青枯菌密度的相对重要性（a）；健康与发病植株在第0周与第5周代谢Q基因（次生代谢产物合成、转运和分解代谢基因）的相对丰度（b）、吞噬型原生动物的相对丰度（c）、芽孢杆菌相对丰度（d）及青枯菌丰度（e）；健康与发病植株中整个生长过程中吞噬型原生动物OTU丰度、细菌OTU丰度与代谢Q基因的共发生网络（f）

结论

通过对植株生长过程中根际细菌、真菌及原生动物的调查，我们发现，除了细菌外，原生动物群落是预测植物健康状态的关键指标。尤其是原生动物的群落组成可以预测植株最终的健康状态。同时，通过线性相关和共生网络分析，我们发现吞噬型原生动物可能通过直接捕食病原菌，以及通过调控细菌群落的结构与功能（产生抑菌性物质能力），进而维持植株健康。这一发现有助于在农作物移栽之前根据土壤原生动物群落预测植株移栽后的健康状态。此外，我们的研究结果也指出吞噬型原生动物在生防方面的潜力，可以用来定向调控根际微生物组，进而提高植物健康状况。

全文链接：

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-020-00799-9