Nature深度报告：CAR-T疗法突破不断，这些新靶点最有希望
经过20年T细胞工程的精细调整，嵌合抗原受体（CAR）T细胞在白血病和淋巴瘤患者中的巨大临床成功导致了该领域研究的指数级增长。2017年，美国FDA首次批准了CAR-T细胞疗法，将该领域推入了一个快节奏的创新研究时代。
自该里程碑事件以来这一领域有了哪些进展？这些进展又将如何影响CAR-T细胞治疗的未来？近期，来自麻省总医院和哈佛医学院的研究人员在Nature Reviews Cancer上发表了一篇综述，简要回顾了CAR的基本设计，介绍了CAR-T细胞疗法的毒性和耐药机制以及克服这些挑战的新颖工程和药物干预措施。作者还讨论了有望在将来1–2年内进入临床的CAR-T细胞疗法新靶点和适应症，以及可能对CAR-T细胞治疗的未来产生重大影响的制造创新。
来源：Nature Reviews Cancer [1]
CAR的改进
1993 年，第一代基于 CD3ζ链的CAR-T细胞被开发出来，其组织结构包含：编码单链可变片段（scFv）的第一代 CAR 的嵌合基因序列、可识别肿瘤相关抗原的抗原结合区、铰链、跨膜结构域（TM）和信号域，如 CD3ζ。
第一代CAR包含细胞内信号域，但没有共刺激分子。这类 CAR-T 细胞在体内的持续扩增有限，不具备大规模杀灭肿瘤细胞的能力，在临床试验中的效果并不理想。
T细胞的完全激活一方面依赖于胞外抗原结合域与抗原的结合所传递的第一信号，另一方面也需要共刺激分子受体与其配体结合所传递的第二信号，而肿瘤细胞表面通常不表达这类共刺激配体。在第一代的基础上，第二代CAR引入一个共刺激结构域CD28或4-1BB，在临床试验中显著改善了CAR-T免疫活性激活的问题，并提高了其作用持久性。
图1 |基本的第二代CAR-T细胞结构示意图。（来源：Nature Reviews Cancer [1]）
用第二代CD19靶向CAR-T细胞治疗的首批B细胞白血病患者具有深远而持久的疗效。因此，CAR-T细胞疗法彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗方法，并因其对CD19+肿瘤的疗效，于2017年获得FDA批准（主要的已发表临床试验结果见表1）。
表1 | 主要的已发表CAR-T细胞疗法试验
目前所有FDA批准的CAR-T细胞产品都是基于第二代设计，具有CD28或4-1BB共刺激域。除CD28和4-1BB外，其他常见的共刺激结构域还包括OX40、CD27和T-细胞可诱导共刺激分子（ICOS）。如果在一个构造中使用两个共刺激域，则认为这是第三代CAR。
一些研究者将具有增强T细胞功能的CAR称为“第四代”CAR，特别是当它们产生额外的蛋白质分子（如细胞因子，IL-12）或拥有额外的受体（如共刺激配体，4-1BBL、CD40L）时。这些CAR也被称为TRUCK（T cells redirected for universal cytokine killing）或“装甲”CAR。
CAR的毒性和耐药机制及相应解决方法
正在显露的毒性机制及解决方案
与CAR-T细胞治疗相关的两个标志性临床毒性是细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性，在临床转化前两者均未通过动物模型预测到。CRS通常在CAR-T细胞治疗的第一周内表现为发热、低血压和呼吸功能不全，血清细胞因子水平较高（图3）。神经毒性表现为暂时性工作记忆丧失、谵妄、癫痫发作和罕见的急性脑水肿。
CRS和神经毒性都归因于分泌细胞因子的T细胞的快速激活和扩增。目前的理解是，由CAR-T细胞和/或配体-受体相互作用分泌的细胞因子激活myeloid compartment的额外免疫细胞，进而释放更多的细胞因子，形成一个激活炎症的循环，即细胞因子风暴。病人体内自然产生的肾上腺素也被证明有助于这种自我放大的循环。
图3 | CAR-T细胞诱导的CRS和神经毒性的分子水平认识和治疗干预现状。（来源：Nature Reviews Cancer [1]）
虽然神经毒性在临床上与CRS有关，但其机制似乎有所不同。患者的严重神经毒性与脑脊液中高水平的促炎细胞因子（IL-6、IL-8、CCL2和CXCL10）相关。血液-脑脊液屏障破坏的证据与神经毒性等级相关，但脑脊液中的白细胞或CAR-T细胞计数不相关。尽管有这些观察，神经毒性的机制目前尚不清楚。然而，作者推测促炎细胞因子的增加可能激活脑血管系统中的内皮细胞，从而导致区域通透性增加和毛细血管渗漏（称为血管源性水肿），表现为局灶性水肿和神经毒性。最近一项研究提出的另一个可能的解释是，脑壁细胞表达CD19，CAR-T细胞对这些细胞的活性导致了神经毒性。
临床上，克服CRS的主要治疗方法是用IL-6受体单抗托珠单抗来阻断细胞因子的反馈回路。皮质类固醇也经常与托珠单抗联合使用，以减少炎症和脑血管源性水肿。然而，这两种干预措施似乎都不能阻止患者体内CAR -T细胞的扩增。
除了IL-6受体阻断剂外，其他的干预措施也在研究中。例如，通过单克隆抗体（lenzilumab）中和或通过基因改变CAR-T细胞以敲除GM-CSF，可以限制CRS和神经炎症；用甲酪氨酸阻断儿茶酚胺可以保护小鼠免受CRS致命并发症的影响；其他研究小组试图控制CAR-T细胞毒性，不是通过解决毒性本身，而是通过使用达沙替尼（一种FDA批准的酪氨酸激酶抑制剂）来控制CAR-T细胞的负荷和效力。
在某些情况下，神经毒性或CRS相关的多器官衰竭可能是致命的。较高的肿瘤负荷和CAR-T细胞扩增与较高的CRS等级相关。总的来说，具有4-1BB共刺激结构域的CAR似乎比那些具有CD28结构域的CAR产生更少的神经毒性和CRS。
耐药机制及解决方案
与CAR-T细胞治疗后复发相关的常见机制之一是抗原丢失（图4上）。选择压力使CD19突变是最常见的抗原丢失机制。此外，有报道揭示通过一个叫做trogocytosis的过程，CAR从肿瘤细胞中去除目标抗原并将其内化，导致肿瘤细胞上的抗原密度降低。这会影响基于CD28和基于4-1BB的CAR-T细胞，但会产生不同的后果，因为基于CD28的CAR对抗原密度降低相对没那么敏感。
防止抗原逃逸最直接的方法是开发针对其他抗原的CAR，这些CAR可以串联使用。靶向CD20和CD22的CAR-T细胞在临床上以独立和串联scFv的两种形式开发。另一种方法是增加靶细胞的抗原表达。小分子γ-分泌酶抑制剂可通过破坏B细胞成熟抗原（BCMA）的裂解来增加骨髓瘤细胞上BCMA的表达。这种靶向BCMA的CAR-T细胞联合治疗目前正在进行临床试验（NCT03502577 ）。
图4 | 抗原依赖性和抗原非依赖性（如T细胞衰竭）耐药。（来源：Nature Reviews Cancer [1]）
抗原丢失可以解释一些复发，但并非所有复发的患者都有抗原阴性问题，这表明可能还有其他因素导致耐药，如CAR-T细胞衰竭。肿瘤细胞中Fas 相关死亡功能域蛋白（FADD）、BH3相互作用域死亡激动剂（BID）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体2（TRAIL2）的缺失使其对CD19靶向CAR-T细胞的疗效更具耐药性，这是因为CAR的细胞毒性和增殖能力较低。此外，缺乏这些死亡受体分子的ALL细胞对CAR的长时间刺激导致T细胞衰竭。
随着免疫检查点阻断技术的发展，肿瘤免疫治疗领域发生了革命性的变化。免疫检查点阻断在克服T细胞衰竭中的作用已被应用于CAR-T细胞，包括组合治疗、CAR-T细胞抗免疫检查点分子的自分泌和CAR-T细胞自身免疫检查点基因的遗传干扰。目前有许多正在进行的临床试验（NCT02650999、NCT02706405、NCT02926833和NCT03310619）评估了CD19靶向CAR-T细胞联合免疫检查点阻断（靶向PD-1或PD-L1）的效果。早期结果表明，联合治疗是安全的，并且毒性低。
目前，CAR-T细胞治疗领域的大多数经验都是关于血液系统恶性肿瘤的治疗，因此肿瘤微环境（TME）在治疗中的作用要小得多。然而，当该领域进展到针对实体瘤的研究时，抑制性TME也可能产生对CAR-T细胞治疗的耐药性。对于难以穿透、高度免疫抑制的实体恶性肿瘤，如胶质母细胞瘤或胰腺癌，尤其值得关注。缺乏吸引CAR-T细胞的趋化因子、异常的血管系统和产生细胞外基质的癌症相关成纤维细胞，都会使CAR-T细胞甚至难以进入肿瘤。
在TME中增强CAR-T细胞的运输以及限制抗炎细胞因子和细胞抑制作用的创新方法也在开发中。一种策略是通过分泌促炎性可溶性因子来增加CAR-T细胞的应答。IL-7和CCL19在CAR-T细胞中的过表达是淋巴器官中形成T细胞区所必需的，这增加了促炎性树突状细胞和T细胞向实体肿瘤组织的浸润，并增强了小鼠模型中肿瘤的消退。另一个策略是重定向或绕过抑制性TME。例如在前列腺癌中，在前列腺特异性膜抗原靶向CAR载体中表达一个dominant-negative TGFβ受体，以减少TGF-β抑制T细胞的活性的作用。这种特殊的CAR结构现在正在进行I期临床试验（NCT03089203）。
有希望的新靶点和适应症
多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤CAR-T细胞治疗的主要靶点是BCMA（NCT02658929 、NCT02546167）。然而，正如CD19靶向CAR-T细胞治疗后出现CD19阴性复发，BCMA阴性复发也可能发生。两个研究小组提出了一个替代选择，即靶向BCMA和另一种在多发性骨髓瘤细胞上表达的分子——跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子（TACI）的基于配体的CAR-T细胞。
G蛋白偶联受体， GPRC5D是多发性骨髓瘤的另一个靶点，其在CD138+多发性骨髓瘤细胞上的表达模式独立于BCMA的表达。一些其他靶点也在开发中，包括CD38、CD138和SLAM家族成员7（SLAMF7）。
实体瘤：泛癌
CAR-T细胞治疗领域的一个主要关注点是其在血液恶性肿瘤之外的适用性。许多因素阻碍了制造有效治疗实体瘤的CAR-T细胞，其中包括缺乏肿瘤特异性抗原和免疫抑制TME。该领域的许多领导者认为，除了CD19之外，只有不到12个可行的CAR-T细胞靶点，而确定在肿瘤中具有高、均匀表达但在健康组织中没有表达的靶点已被证明是困难的。
B7-H3（也称为CD276）免疫检查点分子在过去几年中一直是一种流行的免疫治疗靶点，一些有希望的临床试验（ NCT02982941、NCT02381314、NCT03406949、NCT02628535和 NCT03729596）用单克隆抗体靶向该分子。研究表明，在抗原密度高的情况下，B7-H3靶向CAR-T细胞在体外和体内都是有效的，这在髓母细胞瘤、骨肉瘤和尤文肉瘤等儿科癌症中也是如此。然而，当抗原浓度较低时，B7-H3靶向CAR-T细胞活性较低，提示B7-H3靶向CAR-T细胞治疗可能具有一个有效、无毒的临床治疗窗口。
以间皮素为靶点的CAR-T细胞近年来被广泛应用于胰腺癌、肺癌和卵巢癌等多种疾病。临床前模型是有希望的，一些临床试验正在进行中。初步结果表明，间皮素靶向CAR-T细胞是安全的，并且具有抗肿瘤活性，这对CAR-T细胞在实体瘤治疗中的前景是有希望的。更多的临床研究正在评估间皮素靶向的CAR-T细胞治疗是否可以通过联合免疫检查点阻断来增强T细胞应答。最近，使用基于间皮素靶向T细胞受体融合结构（TRuC）的CAR公布了早期I期结果（NCT03907852）。与传统的CAR-T细胞相比，这些CAR保留了它们的细胞毒性，但具有细胞因子释放更低和疗效更高的特点。
实体瘤：脑癌
脑瘤对免疫疗法浪潮的反应仍然较小。然而，由于大脑独特的生理构造，CAR-T细胞疗法治疗脑瘤是有潜力的。与大分子因血脑屏障而难以进入大脑肿瘤不同，T细胞和T细胞疗法可在静脉输注后渗入大脑。
CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤的初步临床试验以EGFRvIII、IL-13Rα2和HER2（也称为ERBB2）为靶点，但由于靶抗原丢失，治疗效果不佳。为了克服胶质母细胞瘤中经常发现的靶抗原表达的异质性，一种基于chlorotoxin（CLTX）肽的CAR-T细胞被设计出来，即使在没有其他胶质母细胞瘤相关抗原的情况下也具有强大的抗肿瘤活性。靶向CLTX肽的CAR-T细胞治疗可能是有希望的，因为它可能没有先前靶点中发现的抗原异质性问题。
针对神经母细胞瘤的双唾液酸神经节苷脂GD2靶向CAR-T细胞在临床试验中已获得良好的耐受性。研究指出，GD2靶向CAR-T细胞可能对组蛋白H3 K27M（H3-K27M）突变的弥漫性中线胶质瘤（一种普遍致命的儿科癌症）有效。
此外，细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖GPC2也被选为神经母细胞瘤的新靶点。GPC2在神经母细胞瘤组织中高表达，但在正常的儿童组织中不表达，可能也是一种有效的CAR-T细胞靶点。
CAR制造的创新
基因转移
基因重组T细胞疗法的一个局限性是临床上使用昂贵且生产时间长的病毒载体。此外，病毒载体对可编码的DNA长度有大小限制（AAV约4kb，腺病毒约8.5kb，慢病毒载体约10kb）。在过去的10年中，转座子作为一种非病毒的方法被开发用来生产CAR-T细胞，这种基因转移的方法比基于病毒的方法更经济。生物技术公司Poseida Therapeutics目前正在使用基于piggyBac的CAR-T细胞进行两项临床试验 [4,5]。
此外，基于CRISPR–Cas9的电穿孔技术被用于将DNA序列（>1kb）转移到原代人T细胞基因组中的特定位置。然而，值得注意的是，目前这项技术仍然局限于大的基因载荷。除了遗传物质递送方式的改变外，CAR-T细胞制造的改进还涉及T细胞的体外培养。多个研究小组致力于确定适合最佳生长条件的细胞因子混合物。
改善效应细胞类型
目前的生产工艺通常使用来自患者的异质性T细胞（某些情况下CD4+T细胞和CD8+T细胞分离除外）。然而，有证据表明某些T细胞亚群可能比其他亚群更有效。
临床试验已使用中央记忆T细胞制造基于CD28的CD19靶向CAR-T细胞（NCT01318317和NCT01815749）。初步结果表明，这些细胞是有效的，但与批量生产的CD19靶向CAR-T细胞相比，不一定有更长的持久性。其他潜在的有利亚群包括γδT细胞。CD26highCAR-T细胞也被研究，因其在实体瘤模型中具有优越的功能。
目前有几种方法可以使CAR-T细胞产品更像一种“通用”的药物（图5）。其一是分体式、通用和可编程（SUPRA）CAR，其带有一个zip系统来调节T细胞的反应。该方法仍是自体细胞产品，但一个CAR可感知多种抗原并做出响应。还有一种组合方法，使用了两种不同的zip系统，一种具有CD3ζ信号域，另一种具有共刺激域。其他潜在的通用CAR包括基于生物素结合免疫受体的二聚系统和带有新表位标记的switch模块。
图5 | 功效增强的CAR-T细胞亚群和具有可切换靶点的通用CAR。（来源：Nature Reviews Cancer [1]）
同种异体CAR
“现货型”同种异体CAR-T细胞疗法备受追捧，主要是为了改善产品标准化、患者等待时间、物流成本等。但使用同种异体T细胞疗法有两个主要障碍，即引起GvHD和排斥反应。
自然杀伤（NK）细胞由于其固有的抗肿瘤活性，一直被作为同种异体基因产品开发的基础。一种新的方法是从脐血中提取NK细胞，并用抗CD19 CAR载体进行转导。为了提高NK细胞的持久性，研究人员还将加入了IL-15的转基因。
CAR巨噬细胞（CAR-M）也能交叉递呈抗原并激活T细胞。用CAR-M治疗小鼠肺转移和腹腔内癌异种移植模型有效降低了肿瘤负荷。在人源化小鼠中，CAR-M能增强T细胞抗肿瘤应答，单细胞RNA测序显示出促炎性肿瘤微环境的诱导。
CAR还被用来重定向免疫抑制的CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞），作为自身免疫疾病和器官移植的潜在疗法。CAR-Treg细胞的首次临床试验于2019年获得许可，用于预防终末期肾病患者 HLa-a2不匹配肾移植后的排斥反应。此外，一些研究小组已经证明，在体内使用CAR-Treg细胞可以预防同种异体皮肤移植排斥反应。CAR-Treg细胞还被用来改善结肠炎。然而，由于难以从传统T细胞中纯化这一细胞亚群，CAR-Treg细胞的制造仍然是未来临床应用的一个关注点，目前新的纯化方法正在探索中。
图6 | 超越传统的CAR-T细胞：CAR自然杀伤细胞、CAR巨噬细胞和CAR-Treg细胞（来源：Nature Reviews Cancer [1]）
小结
从2017年首个CAR-T细胞疗法获FDA批准以来，针对不同靶点、不同适应证的大量临床试验陆续开展，这些试验结果揭示了新的疗效、毒性和耐药性机制，并催化了新靶点的寻找、信号机制的阐明和新技术的应用。而在CAR设计、转导方法和最佳细胞类型的选择方面的创新，必将会改善和改变许多不同类型癌症的治疗效果。
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