MPB：山大倪金凤组-黄翅大白蚁肠道放线菌的分离与培养
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黄翅大白蚁肠道放线菌的分离与培养
Isolation and cultivation of actinomycetes from the gut of Macrotermes barneyi
蒋宇彤1, #，未建华1, 2, #，李净净1，倪金凤1, *
1微生物技术研究院，微生物技术国家重点实验室，山东大学，青岛市，山东省
2深圳信立泰药业股份有限公司，北京市
*通讯作者邮箱: jinfgni@sdu.edu.cn
摘要：黄翅大白蚁是广泛分布于中国南部地区的一种主要培菌白蚁，为探究培菌白蚁肠道微生物的抗菌防御作用，我们对黄翅大白蚁相关放线菌展开了研究。本方案介绍从黄翅大白蚁肠道分离培养放线菌的方法。
Abstract: The fungus-growing termite Macrotermes barneyi is a major termite widely distributed in southern China. To understand the defense of termite gut microorganisms, the Actinomyces from the gut of M. barneyi were studied. This protocol introduces the method of isolating and cultivating actinomycetes from the intestine of M. barneyi.
关键词： 培菌白蚁，黄翅大白蚁，肠道微生物，放线菌
研究背景：黄翅大白蚁作为一种培菌白蚁, 与特定真菌-鸡枞菌（Termitomyces）共生，在白蚁巢内建立菌圃，培养小白球菌（Termitosphaeria duthiei（Berk.）Ciferri.）为白蚁提供营养(Hager et al., 2013；Ramadhar et al., 2014)。培菌白蚁主要分布在非洲和亚洲热带地区，在植物废弃物的降解过程中发挥重要作用(Aanen et al., 2005)。培菌白蚁自身和菌圃真菌（鸡枞菌）易受多种真菌侵染，但在健康的白蚁蚁巢中只有鸡枞菌生长，白蚁或其共生菌必然存在一定的机制来抵制致病菌，其中放线菌作为次级代谢产物主要产生者，可能起着关键的作用(徐晓 等， 2018)。培菌昆虫相关放线菌是天然产物的广泛来源，结构多样的次级代谢物包括多肽、大环内酯、多烯、醌酮和生物碱等，常参与微生物-宿主的相互作用(未建华 等， 2019)。昆虫肠道、体表及巢穴作为多种微生物的栖息地，蕴含着丰富的放线菌资源，本文主要介绍从培菌白蚁肠道分离放线菌的方法。
材料与试剂
1.无菌培养皿
2.琼脂 (生工生物工程有限公司，产品目录号: A505255)
3.酵母粉 (Oxoid, England, 产品目录号: LP0021)
4.胰蛋白胨 (生工生物工程有限公司，产品目录号: A505247)
5.麸皮琼脂培养基（索莱宝，北京，产品目录号: LA8720）
6.无机盐（NaCl，KCl，Na2HPO4，NaH2PO4，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7 H2O，FeSO4·7 H2O，K2HPO4，MgSO4，(NH4)2SO4，CaCO3，MnCl2·4 H2O，ZnSO4·7 H2O皆购自国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
7.引物合成，PCR产物测序（北京六合华大基因科技股份有限公司）
8.16SrRNA通用引物: 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’); 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）
9.基因组提取试剂盒（Bacterial DNA Kit 500，Omega bio-tek公司，D3350-01）
10.DNA纯化试剂盒（Gel Extraction Kit 200，Omega bio-tek公司，D2500-02）
11.PBS缓冲液（见溶液配方）
12.高氏一号培养基（见溶液配方）
13.可溶性淀粉培养基（见溶液配方）
14.1000×微量盐溶液（见溶液配方）
15.麸皮培养基（见溶液配方）
16.LB 培养基（见溶液配方）
仪器设备
1.超净工作台（品牌AIRTCH）
2.涂布棒
3.分析天平（赛多利斯公司，北京，型号：ALC-110.4&1100.2）
4.高压灭菌器（爱博公司，山东）
5.恒温培养箱（精宏实验设备公司，上海，型号：DNP-9052）
6.恒温水浴摇床（知楚仪器公司，上海）
7.PCR 仪（品牌TaKaRa）
8.电泳仪（六一电泳器材厂公司，北京，型号：DYY-10C）
9.恒温金属浴（博日科技公司，杭州）
10.凝胶成像仪（品牌UVItec）
11.离心机（品牌Eppendorf，型号：Centrifuge 5417）
12.移液器
软件和数据库
1.利用细菌16S序列进行菌种鉴定网站https://www.ezbiocloud.net/identify/; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
2.各国菌种保藏中心网址（可参考各种培养基的配制方法，并且每种微生物都有其对应的培养基）: 1) 德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, https://www.dsmz.de/. 2)日本菌种保藏中心（JCM）Japan Collection of Microorganisms, https://jcm.brc.riken.jp/en/. 3) 韩国菌种保藏中心（KCTC）Korean collection for type cultures, https://kctc.kribb.re.kr/En/Kctc
3.MAGE7.0 软件，下载地址MEGA7.0.26_win64_setup.exe, https://www.megasoftware.net/
实验步骤
一、白蚁肠道放线菌的分离与纯化
1.白蚁前、中肠样品准备参照Wu文章中的方法 (Wu et al., 2012)，解剖后用研磨棒充分研磨样品5-10 min，直至肠道样品呈均质状态。
2.取各个梯度PBS稀释液（101、102、103、104）150 μl分别涂布于高氏一号培养基中，30 °C培养，每天观察平板上菌落生长情况。
3.根据菌落大小和形态，在平板上挑取典型的放线菌菌落（菌落干燥紧致、明显产孢）。
4.通过稀释涂布和划线的方法，经可溶性淀粉培养基纯化至只有同一种菌落，即得到纯化的克隆。
二、白蚁肠道分离菌株的序列分析
1.将纯化的菌株接入20 ml麸皮液体培养基中，30 °C培养3 d后，离心收集菌体。
2.利用基因组试剂盒提取菌株的基因组DNA，用分光光度计和琼脂糖电泳法检测DNA浓度和纯度。
3.利用16S rRNA 通用引物27F 和1492R 扩增16S rRNA，PCR 体系为基因组DNA (50-200 ng/μl) 1 μl，27F1 μl，1492R 1 μl，dNTPs 4 μl，10×Buffer 5 μl, EasyTaq 1 μl，ddH2O 37 μl。PCR 条件为预变性95 °C 5 min；95 °C 30 s，58 °C 45 s，72 °C 2 min，35个PCR循环；终延伸72 °C 10 min。
4.将获得的PCR产物进行琼脂糖（1%）凝胶电泳。
5.切胶回收1500 bp片段，用DNA纯化试剂盒纯化PCR片段，纯化片段送上海生工测序。
6.测序结果利用NCBI Blast比对，取相似性高的序列，利用MAGE7.0 软件邻位法做系统发育树。
结果与分析
从高氏一号培养基上挑选典型的放线菌菌落，在前肠菌悬液稀释 10 倍后的平板上有比较多的具有放线菌特征的菌落。放线菌在黄翅大白蚁肠道不是优势菌，因而在较低的稀释倍数时可以得到较多的放线菌，但同一平板上细菌数目也很多，经多次稀释涂布平板和平板划线后，最后得到 13 株放线菌菌株（表1）。其中工蚁 (Worker) 前肠(Foregut) 来源的有 11 株，为 WF-1、WF-2、WF-3、WF-4、WF-5、WF-6、WF-7、 WF-8、WF-12、WF-13、WF-14，其相似性最高的菌株分别是 Kitasatospora cheerisanensis，K. cheerisanensis，Streptomyces puniceus，S. coelicoflavus，S. tacrolimicus，K. phosalacinea，S. pratensis，S. luridiscabiei，K. purpeofusca，K.purpeofusca 和 S. viridobrunneus，最大相似性为 98.14%—99.93%。从工蚁中肠 ( Midgut )得到 2株放线菌： WM-1 和 WM-3，同 S. badius、S. fumigatiscleroticus 相似性分别为 99.79%和 99.38%。
表1. 基于16S rRNA 的13 株放线菌相似菌株
Table 1. The similar strains of 13 Actinomycetes based on the 16S rRNA sequences
|
Strains |
Most similar strain in NCBI |
Similarity/% |
|
WF-1 |
K. cheerisanensis KCTC 2395(T) |
99.44 |
|
WF-2 |
K. cheerisanensis KCTC 2395(T) |
99.10 |
|
WF-3 |
S. puniceus NBRC 12811(T) |
99.86 |
|
WF-4 |
S. coelicoflavus NBRC 15399(T) |
99.72 |
|
WF-5 |
S. tacrolimicus ATCC 55098(T) |
98.14 |
|
WF-6 |
K. phosalacinea NRRL B-16230(T) |
99.65 |
|
WF-7 |
S. pratensis ch24(T) |
99.64 |
|
WF-8 |
S. luridiscabiei NRRL B-24455(T) |
99.93 |
|
WF-12 |
K. purpeofusca NRRL B-1817(T) |
99.72 |
|
WF-13 |
K. purpeofusca NRRL B-1817(T) |
99.86 |
|
WF-14 |
S. viridobrunneus LMG 20317(T) |
99.38 |
|
WM-1 |
S. badius NRRL B-2567(T) |
99.79 |
|
WM-3 |
S. fumigatiscleroticus NBRC 12999(T) |
99.38 |
T：Type strain
从 NCBI 网站分别下载 13 株菌相似菌株的 16S rRNA 序列，利用 MAGE 7.0 软件中的 Neighbor-joining 法制作进化树，比对方法为 ClustalW。从发育树（图 1）可以看出，WF-1、WF-2、WF-6、WF-12、WF-13 属于 北里孢菌属(Kitasatospora)，WF-3、WF-4、 WF-5、WF-7、WF-8、WF-14、WM-1 和 WM-3 属于 链霉菌属(Streptomyces)，13 株菌都属于链霉菌科 Streptomycetaceae。菌株 WF-5 与 S. tacrolimicus 相似性最高，同源性为 98.14%，低于 98.65%，且系统发育树处于单独的分枝，推测菌株 WF-5是一株新的链霉菌。
图.1 基于16S rRNA 序列的系统发育树分析（邻位法）
Figure 1. Neighbour-joining phylogenetic tree of 13 Actinomycetes based on 16S rRNA genes
注意事项
1.采集到的白蚁材料尽量在新鲜状态下立即解剖，以保证肠道放线菌的分离效果;
2.在解剖白蚁前，清洗消毒白蚁体表，以防止体外菌的污染；
3.解剖过程中先将白蚁头部去掉，按住白蚁用解剖针从尾部缓缓拉出肠道，可以保持肠道的完整性。
溶液配方
1.PBS缓冲液：NaCl 4 g，KCl 0.1 g，Na2HPO4 0.72 g，NaH2PO4 0.12 g，加蒸馏水500 ml，pH 7.4。
2.高氏一号培养基（g/L）：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7 H2O 0.01 g，琼脂18 g，加蒸馏水定容至1 L。
3.可溶性淀粉培养基（g/L）：可溶性淀粉10 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 1 g，NaCl 1 g，(NH4)2SO4 2 g，CaCO3 2 g，微量盐溶液1 ml，加蒸馏水定容至1 L，pH 7.2。
4.1000×微量盐溶液（g/L）：MnCl2·4 H2O 0.1 g, FeSO4·7 H2O 0.1 g, ZnSO4·7 H2O 0.1 g，加蒸馏水定容至1 L。
5.麸皮培养基（/L）：100 g 麸皮加入适量水，沸水煮30 min，经纱布去除沉淀后，加蒸馏水定容至1 L。
6.LB 培养基（g/L）：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，琼脂15 g，加蒸馏水定容至1 L，液体培养基不加琼脂粉。
参考文献
1.Aanen, D. K. and Eggleton, P. (2005). Fungus-growing termites originated in African rain forest. Curr Biol 15(9): 851-855.
2.Hager, F. A. and Kirchner, W. H. (2013). Vibrational long-distance communication in the termites Macrotermes natalensis and Odontotermes sp. J Exp Biol 216(Pt 17): 3249-3256.
3.Ramadhar, T. R., Beemelmanns, C., Currie, C. R. and Clardy, J. (2014). Bacterial symbionts in agricultural systems provide a strategic source for antibiotic discovery. J Antibiot (Tokyo) 67(1): 53-58.
4.未建华和李净净. (2019). 培菌昆虫相关放线菌的次级代谢产物研究进展. 微生物学报 59(10): 1864-1871.
5.徐晓, 孙飞飞, 尹彩萍，王滢和张应烙 (2018). 昆虫共生菌的次级代谢产物研究进展. 微生物学报 58(6): 1126-1140.
6.Wu, Y., Chi, S., Yun, C., Shen, Y., Tokuda, G. and Ni, J. (2012). Molecular cloning and characterization of an endogenous digestive beta-glucosidase from the midgut of the fungus-growing termite Macrotermes barneyi. Insect Mol Biol 21(6): 604-614.
致谢
本项目获得国家重点基础研究发展计划 (973计划，号：2011CB707402)，国家自然科学基金 (编号：31970119, 31272370, 30870085) 及山东大学微生物技术国家重点实验室自主设置课题的支持。