技术干货 | 活体成像中荧光蛋白挑选指南
荧光成像需要对检测的细胞或分子进行荧光标记。标记方法主要有两种，第一种利用内源荧光信号，在细胞中表达荧光蛋白进行标记；第二种利用荧光分子对细胞、药物或纳米颗粒等分子进行标记。目前，很多荧光蛋白被开发并应用到活体成像，如何选择合适的荧光蛋白呢？本期将为大家介绍！
Rainbow of fluorescent proteins [Tsien lab]
选择荧光蛋白应考虑的五大因素
1 激发波长/发射波长
每一种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长。因此，选择的荧光蛋白必须是所用成像系统能够激发和检测到的。比如，使用的成像系统只有两个激发光源：488 nm和561 nm。那就不可以选择远红外荧光蛋白。同时使用超过一个荧光蛋白时，必须确保发射波长没有重叠。
荧光蛋白应用于活体成像实验时，尽量选择红色或近红外的荧光蛋白，这类荧光蛋白的发射波长较长，具有更好的组织穿透能力。
2 寡聚反应
早期开发的荧光蛋白易于寡聚化，与目的基因融合表达时，可能会影响目的基因蛋白的生物学功能。建议使用单体的荧光蛋白，比如mCherry。
3 亮度
荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下，将荧光蛋白的亮度与EGFP(设定为1)进行比较，有一些荧光蛋白非常暗淡（例如TagRFP657，其具有亮度只有0.1）。因此活体成像实验时，亮度也需要考虑。
4 pH稳定性
如果计划在酸性环境中表达荧光蛋白，则此参数非常重要，一些荧光蛋白具有不同的激发/发射光谱（例如mKeima），或在pH变化时荧光强度会发生改变（例如pHluorin，pHTomato）。
5 避免自发荧光
生物体自身的很多物质具有较强的自发荧光，如指甲、毛发具有强烈的绿色背景信号。因此活体成像时，需要对动物进行完全脱毛处理或尽量避免绿色荧光蛋白，可选RFP、dsRed, mCherry, mTomato等荧光蛋白。
选择好荧光蛋白后，接下来就是做实验了。
1 应用清晰
FOBI 整体荧光成像系统专业用于荧光成像，针对荧光成像应用而设计。内置四种不同的荧光通道：蓝 (460 nm)、绿 (520 nm)、红 (630 nm)、红外 (730 nm)，可对各种荧光蛋白和染料的进行检测。
2. 小巧方便、性能稳定
仪器整体结构紧凑，性能稳定，体积小，重量轻，占用空间小。尺寸 : 260 x 260 x 400 mm；重量仅9 kg。结构设计合理，采用LED漫射型光源，使样本受到均匀激发，相对定量分析更加准确。
3 . 实时，真彩色
SONY 140万像素真彩色CCD，能使荧光信号的观察更加直观、清晰。系统具备录制视频功能，可实时观测动物状态，或实时进行动物手术操作。
成像结果展示
对绿色荧光蛋白表达的肿瘤与Cy5.5标记的药物进行成像
对绿色荧光蛋白表达的大米进行成像