HNSCC数据分析-GSE2379-GPL830-GPL91 / 四六文摘

五月份的学徒专注于GEO数据库里面的表达量芯片数据处理，主要的难点是表达量矩阵获取和探针的基因名字转换，合理的分组后就是标准的差异分析，富集分析。主要是参考我八年前的笔记：

下面是sophie的投稿

数据集介绍

GEO链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE2379
芯片平台：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL91 [HG_U95A] Affymetrix Human Genome U95A Array

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL8300 [HG_U95Av2] Affymetrix Human Genome U95 Version 2 Array
样品列表：

GSM44794 VADS_0103_T_NM GSM44799 VADS_01047_N GSM44802 VADS_01047_T_E GSM44806 VADS_0118_T_LR GSM44809 VADS_0135_T_M GSM44810 VADS_0165_T_M GSM44811 VADS_0167_T_NM GSM44812 VADS_0203_T_M GSM44813 VADS_0215_T_M GSM44814 VADS_0218_T_M ...

文章是：Identification of genes associated with tumorigenesis and metastatic potential of hypopharyngeal cancer by microarray analysis. Oncogene 2004 Apr 1;23(14):2484-98. PMID: 14676830 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14676830

核心步骤

R包加载

rm(list = ls()) library(AnnoProbe) library(GEOquery) library(ggplot2) library(ggstatsplot) library(reshape2) library(patchwork)

获取并且检查表达量矩阵

主要是得是否需要log

# 获取表达量矩阵 gse_number <- 'GSE2379' gset <- geoChina(gse_number) a=gset[[1]] dat1=exprs(a) dim(dat1) a@annotation b=gset[[2]] dat2=exprs(b) dim(dat2) b@annotation gpl_number = paste(a@annotation,b@annotation,sep = "_");gpl_number dat1 = dat1[intersect(rownames(dat1),rownames(dat2)),] dat2 = dat2[intersect(rownames(dat1),rownames(dat2)),] dat = cbind(dat1,dat2) # 检查，判断需不需要取log dat[1:4,1:4] dat = log2(dat) boxplot(dat[,1:4],las=2) library(limma) dat=normalizeBetweenArrays(dat)

# 画图，使用ggplot需宽数据变长数据 class(dat) data <- as.data.frame(dat) data <- melt(data) head(data) title <- paste (gse_number, "/", gpl_number, sep ="") p1 <- ggplot(data,aes(x=variable,y=value))+ geom_boxplot()+ theme_ggstatsplot()+ theme(panel.grid = element_blank(), axis.text=element_text(size=10,face = 'bold'), axis.text.x=element_text(angle=90), plot.title = element_text(hjust = 0.5,size =15))+ xlab('')+ ylab('')+ ggtitle(title) p1

可以看到，处理前后我们的表达量矩阵的表达量范围箱线图如下所示：

根据生物学背景及研究目的人为分组

library(stringr) pd1=pData(a) pd2=pData(b) #通过查看说明书知道取对象a里的临床信息用pData group_list1=ifelse(grepl('Normal',pd1$source_name_ch1),'control','HNSCC') group_list2=ifelse(grepl('Normal',pd2$source_name_ch1),'control','HNSCC') group_list = factor(c(group_list1,group_list2),levels = c('control','HNSCC'));table(group_list)

为了演示方便，我们这里仅仅是区分"HNSCC"和“control”。

probe_id 和symbol的转换至表达矩阵

获取芯片注释信息

代码如下：

gpl_number ids1 = idmap("GPL8300") ids2 = idmap("GPL91") ids1 = ids1[ids1$probe_id == intersect(ids1[,1],ids2[,1]),] ids2 = ids2[ids2$probe_id == intersect(ids1[,1],ids2[,1]),] ids =ids1 #所以ids1和ids2用哪个都行

可以看到此芯片的探针与基因ID或者symbol的对应关系如下所示：

> head(ids) probe_id symbol 50246 1000_at MAPK3 50247 1001_at TIE1 50248 1002_f_at CYP2C19 50249 1003_s_at CXCR5 50250 1004_at CXCR5 50251 1005_at DUSP1

探针基因ID对应以及去冗余

代码如下：

library(tidyr) library(dplyr) library(stringr) #接下来，使探针与基因symbol一一对应 ids=as.data.frame(ids) table(rownames(dat) %in% ids$probe_id) dat=dat[rownames(dat) %in% ids$probe_id,] ids=ids[match(rownames(dat),ids$probe_id),] ids$probe_id=as.character(ids$probe_id) rownames(dat)=ids$probe_id ids=ids[ids$probe_id %in% rownames(dat),] dat=dat[ids$probe_id,]

#下一步是：基因symbol去冗余-按照表达量最大值筛选 ids$median=apply(dat,1,median) #ids新建median这一列，列名为median，同时对dat这个矩阵按行操作，取每一行的中位数，将结果给到median这一列的每一行 ids=ids[order(ids$symbol,ids$median,decreasing = T),] #对ids$symbol按照ids$median中位数从大到小排列的顺序排序，将对应的行赋值为一个新的ids ids=ids[!duplicated(ids$symbol),]#将symbol这一列取取出重复项，'!'为否，即取出不重复的项，去除重复的gene ，保留每个基因最大表达量结果s #获得去冗余之后的dat/exp dat=dat[ids$probe_id,] #新的ids取出probe_id这一列，将dat按照取出的这一列中的每一行组成一个新的dat #把ids的symbol这一列中的每一行给dat作为dat的行名 rownames(dat)=ids$symbol table(group_list)

最后得到了表达量矩阵如下所示：

> dat[1:4,1:4] #保留每个基因ID第一次出现的信息 GSM44794 GSM44806 GSM44810 GSM44811 ZZZ3 9.596521 8.811690 8.757934 9.441529 ZZEF1 8.961444 8.386062 9.018706 7.834171 ZYX 11.655007 11.279106 11.409222 11.224499 ZWINT 9.822704 10.807418 9.362317 10.333218

以及最简单的2分组，如下所示：

>table(group_list) group_list control HNSCC 4 34

保存为R数据文件：step1-output.Rdata

标准步骤之质控

得到标准的3张图，包括主成分分析，高变基因的表达量热图，样品相关性热图

## 下面是画PCA的必须操作，需要看说明书。 exp <- dat exp=t(exp)#画PCA图时要求是行名时样本名，列名时探针名，因此此时需要转换 exp=as.data.frame(exp)#将matrix转换为data.frame library("FactoMineR")#画主成分分析图需要加载这两个包 library("factoextra") dat.pca <- PCA(exp , graph = FALSE)#现在exp最后一列是group_list，需要重新赋值给一个dat.pca,这个矩阵是不含有分组信息的


# 画图，主成分分析图p2

this_title <- paste0(gse_number,'_PCA')

p2 <- fviz_pca_ind(dat.pca,

geom.ind = "point", # show points only (nbut not "text")

col.ind = group_list, # color by groups

palette = "Dark2",

addEllipses = TRUE, # Concentration ellipses

legend.title = "Groups")+

ggtitle(this_title)+

theme_ggstatsplot()+

theme(plot.title = element_text(size=15,hjust = 0.5))
p2
# 下面是1000_sd热图

library(pheatmap)

cg=names(tail(sort(apply(dat,1,sd)),1000))#apply按行（'1'是按行取，'2'是按列取）取每一行的方差，从小到大排序，取最大的1000个

n=t(scale(t(dat[cg,])))

n[n>2]=2

n[n< -2]= -2

n[1:4,1:4]

ac=data.frame(Group=group_list)

rownames(ac)=colnames(n)

# 画图，高变基因的表达量热图p3

p3 <- pheatmap::pheatmap(n,

show_colnames =F,

show_rownames = F,

main = gse_number,

annotation_col=ac,

breaks = seq(-3,3,length.out = 100))#因为已经手动设置了表达量最大值，所以，可以不用设置break

p3

# 画图，样品相关性热图p4 colD=data.frame(Group=group_list) exprSet=t(exp) rownames(colD)=colnames(exprSet)#问题-exprSet设置成转置后的exp p4 <- pheatmap::pheatmap(cor(exprSet),#热图对样本-列操作 annotation_col = colD, show_rownames = F, show_colnames = F, main = gse_number ) p4

出图如下：

标准步骤之limma差异分析

代码如下：

library(limma) design=model.matrix(~factor( group_list )) fit=lmFit(dat,design) fit=eBayes(fit) options(digits = 4) #设置全局的数字有效位数为4 deg = topTable(fit,coef=2,adjust='BH', n=Inf) #非常重要的一步，记得检查差异分析是否正确 boxplot(dat[rownames(deg)[1],]~group_list ) deg[1,]

差异分析结果前10行如下所示：

> deg[1:10,] logFC AveExpr t P.Value adj.P.Val B MMP1 6.935 11.784 14.506 1.947e-17 1.669e-13 28.69 AGFG2 -3.247 6.510 -11.559 2.907e-14 1.245e-10 22.02 CAPN5 -3.768 6.238 -9.753 4.397e-12 1.142e-08 17.32 COL4A1 3.426 11.582 9.687 5.329e-12 1.142e-08 17.13 EMP1 -4.196 9.768 -9.221 2.090e-11 2.882e-08 15.84 PLAUR 3.486 11.456 9.215 2.126e-11 2.882e-08 15.82 ITGA1 2.976 8.334 9.180 2.354e-11 2.882e-08 15.73 PTPN14 2.542 7.672 9.106 2.937e-11 3.146e-08 15.52 LOXL2 3.081 8.678 8.639 1.197e-10 1.139e-07 14.18 MMP12 3.993 10.371 8.586 1.404e-10 1.180e-07 14.03

有了差异分析就可以进行标准的可视化，包括火山图和上下调的差异基因热图

nrDEG=deg head(nrDEG) attach(nrDEG) plot(logFC,-log10(P.Value))#简单画图看一下 df=nrDEG df$v= -log10(P.Value) #df新增加一列'v',作为新的绘图参数，值为-log10(P.Value) #设定上下调基因 df$g=ifelse(df$P.Value>0.05,'stable', ifelse( df$logFC >2,'up', ifelse( df$logFC < -2,'down','stable') ) ) #统计上下调基因数量 table(df$g) #给绘制火山图用的数据新增一列symbol df$name=rownames(df) head(df) logFC_t = 2 #设置可循环使用的plot标题 this_tile <- paste0('Cutoff for logFC is ',round(logFC_t,3), '\nThe number of up gene is ',nrow(df[df$g == 'up',]) , '\nThe number of down gene is ',nrow(df[df$g == 'down',]) ) #画图，火山图p5 p5 <- ggplot(data = df, aes(x = logFC, y = -log10(P.Value))) + geom_point(alpha=0.6, size=1.5, aes(color=g)) + ylab("-log10(Pvalue)")+ scale_color_manual(values=c("#34bfb5", "#828586","#ff6633"))+ geom_vline(xintercept= 0,lty=4,col="grey",lwd=0.8) + xlim(-3, 3)+ theme_classic()+ ggtitle(this_tile )+ theme(plot.title = element_text(size=12,hjust = 0.5), legend.title = element_blank(), ) p5

#热图 library(pheatmap) x=deg$logFC names(x)=rownames(deg) cg=c(names(head(sort(x),100)), names(tail(sort(x),100)))#对x进行从小到大排列，取前100及后100，并取其对应的探针名，作为向量赋值给cg n=t(scale(t(dat[cg,]))) n[n>2]=2 n[n< -2]= -2 n[1:4,1:4] pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F) ac=data.frame(group=group_list) rownames(ac)=colnames(n) # 画图，上下调的差异基因热图p6 p6 <- pheatmap(n,show_colnames =F, show_rownames = F, cluster_cols = T, main = gse_number, annotation_col=ac) p6

出图如下:

标准步骤之生物学功能数据库注释

我们这里不根据任何武断的阈值来区分统计学显著的上下调基因，而是直接根据基因的变化情况排序进行gsea分析，而且仅仅是展示kegg这个生物学功能数据库的注释情况！

gsea分析需要基因的ENTREZID，需要根据物种进行转换

# 加ENTREZID列，用于富集分析（symbol转entrezid，然后inner_join） deg$symbol=rownames(deg) library(org.Hs.eg.db) library(clusterProfiler) s2e <- bitr(deg$symbol, fromType = "SYMBOL", toType = "ENTREZID", OrgDb = org.Hs.eg.db)#人 #bitr()用于SYMBOL转ENTREZID #其他物种http://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___OrgDb dim(deg) dim(s2e) setdiff(deg$symbol,s2e$SYMBOL) DEG <- inner_join(deg,s2e,by=c("symbol"="SYMBOL"))

gsea富集

library(dplyr) library(ggplot2) geneList=DEG$logFC names(geneList)=DEG$ENTREZID geneList=sort(geneList,decreasing = T) head(geneList) library(clusterProfiler) kk_gse <- gseKEGG(geneList = geneList, organism = 'hsa',#按需替换 #nPerm = 1000, minGSSize = 10, pvalueCutoff = 0.9, verbose = FALSE) tmp=kk_gse@result dim(tmp) kk=DOSE::setReadable(kk_gse, OrgDb='org.Hs.eg.db',keyType='ENTREZID')#按需替换 #DOSE::setReadable():mapping geneID to gene Symbol tmp=kk@result dim(tmp) pro='comp1' write.csv(kk@result,paste0(pro,'_kegg.gsea.csv')) save(kk,file = 'gsea_kk.Rdata')

富集可视化

上面的kk这个变量就存储了kegg这个生物学功能数据库的gsea分析结果，我们进行简单可视化，代码如下：

# 展现前6个上调通路和6个下调通路 down_k <- kk_gse[tail(order(kk_gse$enrichmentScore,decreasing = F)),];down_k$group=-1 up_k <- kk_gse[head(order(kk_gse$enrichmentScore,decreasing = F)),];up_k$group=1

dat=rbind(up_k,down_k) colnames(dat) dat$pvalue = -log10(dat$pvalue) dat$pvalue=dat$pvalue*dat$group dat=dat[order(dat$pvalue,decreasing = F),] # gsea分析结果p7 p7<- ggplot(dat, aes(x=reorder(Description,order(pvalue, decreasing = F)), y=pvalue, fill=group)) + geom_bar(stat="identity") + scale_fill_gradient(low="#34bfb5",high="#ff6633",guide = FALSE) + scale_x_discrete(name ="Pathway names") + scale_y_continuous(name ="log10P-value") + coord_flip() + theme_ggstatsplot()+ theme(plot.title = element_text(size = 15,hjust = 0.5), axis.text = element_text(size = 12,face = 'bold'), panel.grid = element_blank())+ ggtitle("Pathway Enrichment") p7 #具体看上面条形图里面的每个通路的gsea分布情况p8 library(enrichplot) p8 <- gseaplot2(kk, geneSetID = rownames(down_k))+ gseaplot2(kk, geneSetID = rownames(up_k)) p8

出图如下：

HNSCC数据分析-GSE2379-GPL830-GPL91

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如果你也有类似的数据分析需求，却苦于不会写代码，可以考虑找我们的工程师帮忙哦！

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