原创解读|The Plant Journal-四倍体小麦抗秆锈病基因Sr13的功能与进化研究
小麦秆锈病由病原菌Puccinia graminis Pers. f. sp. tritici (Pgt)引起，严重时会造成小麦的颗粒无收。自1998年在东非发现Sr31强毒株TTKSK以来，不断有新的秆锈病毒力小种涌现，如Ug99、TRTTF、TKTTF等，严重地威胁着全世界的小麦生产。而解决这一挑战的最佳方法是发掘小麦基因库中的抗秆锈基因，并将其用于小麦育种工程。源于四倍体小麦的抗秆锈基因Sr2、Sr9e、Sr9g、Sr11、Sr12、Sr13、Sr14和Sr8155B1已被先后报道，其中Sr13被鉴定为一个NLR基因。基于LRR区域的DNA序列多态性和对TTKSK小种的抗性反应，发现该基因目前的单倍型有十三种（R1、R2、R3和S1-S10），其中单倍型R1/R3和R2被分别命名为Sr13a和Sr13b（Zhang et al., 2017）。
作者在对两个四倍体小麦T. carthlicum accession PI387696和T. polonicum accession CItr14803进行抗秆锈遗传分析和基因定位时发现，两个品系的抗秆锈基因可能与Sr13相关，随后对其进行精细分析，并展开了Sr13基因的进化研究，以下是具体结果：
作者将感秆锈病品系Rusty与PI387696杂交，对其F1、F2和RIL（F7）群体接种秆锈病小种TTKSK、TRTTF和TMLKC，发现所有的F1植株表型与亲本PI387696相似，F2群体抗感分离比符合3:1，RIL群体抗感分离比符合1:1，从而确定品系PI387696携带的抗秆锈基因是一个单显性基因（图1）。随后对两个亲本及RIL群体进行90K iSelect SNP芯片分析，利用筛选出的多态性标记，构建遗传连锁图谱，定位了一个主效QTL，并命名为QSr.rwg-6A.3（位于6AL远端）。利用Sr13特异的KASP标记对RIL群体进行基因分型，再结合Sr13标记BE403950、CK20734和STARP标记rwgsnp6的连锁分析，证实品系PI387696携带的Sr基因为Sr13（图2）。
图1. Rusty x PI387696组合F1、F2和重组自交系植株接种Pgt小种TMLKC后的感染类型
a：Rusty，b：PI387696，c：F1 plant，d：F2 resistant plant，e：F2 susceptible plant，f：resistant RIL plant，g：susceptible RIL plant
图2. 染色体6AL上Sr13相关标记的定位分析
2. 品系CItr14803抗秆锈基因的鉴定
作者对Rusty和Cltr14803的180个BC1F2家系进行秆锈病（TMLKC）测试，每个家系选择二十五株接种，分别观察到53个纯合感病、82个感抗分离和45个纯合抗病家系，卡方检验分析符合1:2:1的比例（χ2 = 2.133, p = 0.344）。随后对该群体进行BSA分析以及KASPSr13标记分析，证明Cltr14803所携带的抗秆锈基因位于6AL上Sr13基因座。
标记rwgsnp37.2可以用于检测携带Sr13基因的小麦品系，标记rwgsnp38、rwgsnp39和rwgsnp40可以用于检测Sr13基因的单倍型R1、R2和R3。在此过程中，作者发现单基因系CAT-A1携带了一个新的单倍型，并命名为R4（图3）。随后对四个单倍型的DNA序列和氨基酸序列进行了比对分析，发现R4与S1仅有T2200C位点存在差异，与R1的差异体现在G1963C/G655R和2272C/V758L位点，与R2和R3的差异分别体现在C2798A/T933K和G2517T/W839C位点，进一步说明CAT-A1的CNL13序列为一个新的R单倍型（表1）。
图3. 四倍体品系中Sr13基因的单倍型分析
4. 比较分析Sr13单倍型（R1、R2和R3）对多个Pgt小种的抗性反应
图4. 9种硬粒小麦接种秆锈小种TCMJC后的表型分析
1995年，Klindworth等利用22个北美秆锈小种对9个单基因系进行秆锈病调查显示，R1基因型对小种THTSC和TCMJC显示是感病的，R2基因型对小种RCCNC、QCCJC和QFCSC是感病的，R4单倍型对T组的小种THTSC、TCMJC、TCCJC和TPPKC 显示是感病的，R3基因型则对所有的调查的小种显示抗性。因此，作者认为R4既不是Sr13b，也不是Sr13c，随后将重点放在了R1与R4的比较分析。进一步的多小种抗性分析发现，R4基因型品系 (CAT-A1) 对秆锈小种TTKSK是感病的，而单基因系R1-R3均是抗病的，说明R4是一个新的等位基因，并将命名为Sr13d（表3）。
总结：抗性基因Sr13是硬粒小麦中控制小麦杆锈病的重要基因之一。Sr13功能基因CNL13具有单倍型R1、R2和R3。R1/R3和R2单倍型最初分别被指定为等位基因Sr13a和Sr13b。为了方便检测Sr13等位基因，作者根据CNL13序列开发了KASP标记KASPSr13和4个STARP标记rwgsnp37至rwgsnp40，这些标记可用于检测四倍体小麦种质中不同的R1-R3单倍型。作者观察到CAT-A1品系中存在一个新的Sr13单倍型（R4），序列分析显示，CAT-A1的CNL13与易感单倍型S1的LRR区有1个核苷酸(C2200T)差异，与其他3个R单倍型有1-2个核苷酸差异。多小种秆锈病试验表明，R1与R3对小种TCMJC和THTSC的敏感性不同，而R4对TTKSK、TPPKC和TCCJC的敏感性不同。基于这些差异，作者将R1、R3和R4单倍型分别命名为等位基因Sr13a、Sr13c和Sr13d。研究表明，Sr13d可能是通过点突变起源于S1单倍型的原始功能等位基因，其他3个R等位基因可能通过1-2个额外的点突变源自Sr13d。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.15263