综述 | Trends Biotechnol.：以RNA为中心的方法：特定RNA转录本组学间的相互作用
编译：向阳而生，编辑：Tracy、江舜尧。
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RNA和蛋白质间的相互作用在众多与健康和疾病相关的细胞学过程中发挥重要作用。最近几年中，全局性的RNA-结合的蛋白质组学被进行了详尽的研究，揭示了很多之前未知的RNA结合蛋白。但是，对于哪种特定的蛋白质与哪种特定的RNA转录本结合知之甚少。在这篇综述中，我们综述了鉴定RNA-蛋白质互作的方法，特别聚焦于组学间互作过程以及可找到特定RNA转录本的方法。最终，我们讨论了未来的挑战和发展方向，包括通过CRISPR-RNA靶标系统研究内源RNA-蛋白质互作的潜力。
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内容
1. 研究RNA-蛋白质复合物互作的重要性
各种类型的RNA，比如mRNAs、rRNAs、以及长链非编码RNAs（lncRNAs），参与了众多的细胞生物学过程。此前人们对于RNA经典的观点是认为它是蛋白质合成的模板，但目前此观点已被拓展成为催化、结构、以及调控方面的功能。RNAs与RNA结合蛋白（RBPs）相互作用，在RNA的功能和最终命运方面发挥了关键性的作用，比如在mRNA翻译和装配的过程中；另外，RNA的结合也能够改变蛋白质的功能和命运，例如调控蛋白质的稳定性和定位方面，这些以RNA-蛋白质互作为特征的作用过程在疾病中的重要性也是不言自明的。任何在表达水平、结构、定位、或者RNA和蛋白质水平修饰的任何变化都可能干扰这些互作过程并导致相应细胞学过程出现偏差，例如，RNA水平的甲基腺苷的修饰（m6A）可影响蛋白质的结合，而通常m6A水平的改变在癌症中可观察到。
为了鉴别出RNA-蛋白质的互作，目前已有一系列的检测方法，通常分为蛋白质为中心的方法和RNA为中心的方法。蛋白质为中心的方法，比如交联免疫沉淀法（CLIP）是基于对目标蛋白免疫沉淀后再对其相关RNAs进行测序，而RNA为中心的方法基于分离那些与感兴趣RNA相关联的蛋白质。这些方法导致了很多RNA结合蛋白（RBPs）的发现，包括一些预期外的蛋白，比如代谢酶类和转录因子。在这篇综述中，我们提供了当前涌现出的以RNA为中心方法的概览，此外，我们还重点强调了这些方法的优点，缺点以及提高需要克服的挑战；不仅如此，我们讨论了潜在的技术革新，为内源的蛋白质-RNA互作组提供了一些观点。
2. 全局性的RNA-结合蛋白质组
为了获得一些RNA-蛋白质互作的认识，最近几年，一些方法被用于鉴别全局性的RNA-结合的蛋白组。这些方法是通过交联反应以er进行RNA-蛋白质的互作，而通常随之而来的是细胞裂解和对RNA-蛋白质复合物的纯化。对于所有细胞中RNA-蛋白质复合物的纯化研究者可通过以下多种途径进行，例如，总RNA-相关的蛋白质纯化（TRAPP）是基于结合核酸的硅基阵列；而其他方法，比如正交有机相分离（OOPS），蛋白质交联的RNA提取（XRNAX），或者甲酚苯甲醇提取（Ptex），是通过有机相对交联的RNA-蛋白质复合物进行提取的；另外，具有多聚腺苷酸的RNA-蛋白质复合物可通过Oligo-dT偶联的磁珠进行纯化，这种方法通常被称为是RNA互作组的捕获（RIC），且这种方法可被用于研究各种生物学过程，例如，Liepelt及其同事通过研究了RNA-结合的蛋白组在脂多糖（LPS）刺激后在大分子方面的改变，因此获得了在先天性免疫方面很重要的信号通路；而在另一个研究中，oligo-dT的捕获被应用以抑制RNA去甲基酶后确定RNA结合的蛋白组的变化，因此鉴别出m6A-调节的RBPs；此外，oligo-dT捕获方法适用于精确的定位于RNA结合的蛋白质位点，这些研究以及与其相似的研究使得我们能够描绘RNA-结合的蛋白组的特点，鉴别出已知的和未知的一些RBPs。但是，在研究全局性RNA-结合的蛋白质组的过程中一些问题仍然存在，RNA-蛋白质互作过程具有哪些功能，它们怎样被调控？为了回答这些问题，针对特定RNA转录本的互作组的特征需要进行研究，以提供RNAs，蛋白质及其互作关系的一些新的观点。
图1 对于RNA为中心方法对于检测RNA-蛋白质互作的图示
（A）全局性的RNA结合蛋白质组可通过有机相进行分离。（B）RNA杂交捕获方法，采用oligo-dT偶联的磁珠研究与多聚腺苷酸结合的RNA的蛋白质。（C）对于RNA亲和纯化，一个RNA的诱饵与固相支持物连接（i）或者固定于磁珠上（ii）。蛋白质提取物在体外被施加于RNA-蛋白质互作过程中。（D）RNA杂交捕获方法采用与特定RNA转录本与反义DNA多聚核苷酸之间退火杂交。（E）RNA契合寡聚物策略依赖于寡聚物标记的RNA的共表达以及壳蛋白与活细胞标签的融合。壳蛋白可被特定的抗体识别并下拉（pulldown）目标RNA或者可与邻近的生物素标记的酶相融合，以标记邻近的蛋白。（F）在基于dCas13的策略中，gRNA可募集具有催化活性的失活的Cas13（dCas13）与生物素标记的酶相融合，特异性的针对目标RNA。通过添加生物素，生物素标记的酶可使邻近的蛋白质生物素化。
缩写：RBP，RNA结合蛋白；RNPs，核蛋白微粒
3. 体外包装RNA-蛋白质复合物
已经开发出大量的体外RNA亲和性纯化手段，以鉴别与感兴趣的RNA序列互作的蛋白质（图1C）。一般情况下，RNA诱饵被固定在磁珠上，并且与从组织或者细胞中提取出的蛋白质共孵育；然后，未结合上的蛋白质被洗掉，结合上的蛋白质被纯化并通过Western Blot或者通过质谱进行鉴定（图2A）。该策略已经被广泛的接受，并且各种不同的策略已经被开发出来，例如，磁珠固定可采用化学改性或者RNA标签来实现；不同类型的蛋白质混合物可以被使用，比如细胞核或者细胞质提取物。这些手段证实了RNA亲和性纯化可被应用于解决各种生物学问题当中。在Grabowski和Sharp在1986年首次对他们的研究进行描述后（他们首先对RNA结合小的细胞和RNAs进行了研究），RNA亲和性纯化就被应用于蛋白质与特定RNA序列的结合、RNA次级结构以及RNA修饰等方面（图2B）。
图2 RNA亲和性纯化
（A）RNA亲和性纯化过程的流程图。在此例中，一个生物素标记的RNA诱饵被固定于抗生蛋白链霉素的磁珠上。另一种情况，RNA诱饵固定于固相支持物，正如正文中图1A所示。蛋白质提取物与RNA诱饵共孵育以在体外捕获包装好的RNA-蛋白质的互作效应。接着，未结合的蛋白质通过严谨的洗脱步骤被去除，而已结合上的蛋白被洗脱。被洗脱的蛋白通过Western Blot或者质谱分析进行后续的处理。（B）RNA与蛋白质的结合可收到RNA序列的影响（例如：二级结构或者核酸突变体，包括5甲基胞嘧啶（m5C），假尿嘧啶核苷（Ψ），以及N6-甲基腺苷（m6A），可通过RNA亲和纯化方法进行研究）。（C）通过定量质谱获得的蛋白质的比例的散点图图示。在半定量质谱法中，蛋白或者多肽被同位素标记以区别试验组和对照组。对两种标记的蛋白质比例（试验组样本和对照组样本）进行计算，通过对离群点进行统计鉴别出具有差异的结合蛋白。（D）蛋白与感兴趣RNA结合的亲和度可通过对一系列RNA诱饵进行稀释来获得。半数蛋白质结合时RNA诱饵的浓度被称为解离常数（Kd），一种度量结合亲和度的指标。
被广泛使用的RNA亲和纯化法的普遍使用是由于此方法的便利性，无需任何遗传学的操作。最近在试验手段和质谱技术方面的进展使得亲和纯化法具有较高的通量，因此可提高鉴定准确性和降低试验成本；不仅如此，采用核酸固定的方法所进行的亲和纯化不仅局限于确定结合的特异性（无论互作是否发生）（图2C），也能够被用于确定结合的亲和力（例如：互作的强度）（图2D）。
虽然亲和纯化法在院里上易于操作，但需要小心设计试验时要避免假阳性的发生。RNA与蛋白质的结合受到多种因素的影响，比如序列的特异性以及RNA的次级结构。与在体内相比，由于链接序列不固定或者RNA诱饵长度的变化，特定的RNA序列在体外适合不同二级结构的情况。另一个问题是某些蛋白质的结合依赖于位于感兴趣的结构域的上游或者下游的结构域，当采用相对短的诱饵时可能会错过这些蛋白质。使用较长的RNA诱饵能够避免这些问题的出现，但是诱饵长度越长，就会有越多的蛋白质与之结合，这将增加质谱检测的背景噪音，这种方法也阻止了通过质谱鉴别低丰度特定互作蛋白的鉴别；另外，孵育和洗涤条件能够影响对于互作蛋白质的鉴别，特别是亲和纯化不能够很好的捕获弱的和瞬时的互作蛋白。一些试验步骤可被优化以增加鉴别速率，比如对提取物的预清除或者在试验过程中为了消除非特异性结合而使用的竞争物。此外，现代质谱法持续的提高敏感性和测序速率使得在短时间内可鉴别出更多的蛋白质，这增加了通过一步亲和纯化法获得的粗裂解物的产量增加。总之，RNA亲和纯化是一种有力的研究RNA-蛋白质相互作用分子机制的工具，但是这些在体外发生的互作关系需要在体内进行进一步的试验验证。
4. 体内包装RNA-蛋白质复合物
除了基于体外的方法，已开发出一些在体内包装RNA-蛋白质复合物的方法。这些方法可被分为3大类：RNA杂交；RNA标签；或者基于CRISPR的RNA靶标（图1D-F）。
4.1 RNA杂交捕获
RNA反义链的纯化可被用于鉴别跨基因组的内源RAN的结合位点，但是在最近几年中这种方法也被用于鉴别RNA-蛋白质的互作。在这种方法中，RNA与蛋白质的互作在细胞中发生并首先被交联反应所固定，接着研究者采用特定的生物素标签的反义RNA寡聚核苷酸捕获目标RNA。RNA-蛋白质复合物采用链霉素包被的磁珠进行纯化，经洗涤后，结合的蛋白被洗脱并通过质谱进行鉴定（图3A）。
图3 在体内研究聚合的RNA-蛋白质互作的方法
（A）RNA杂交捕获的流程图。简要的说，细胞内的RNA-蛋白质互作通过交联反应进行保存。RNA-蛋白质发生交联反应的位点用橙色进行标识。在细胞裂解后，通过生物素标记的DNA反义的寡聚核苷酸与靶标RNA进行杂交，RNA-蛋白质复合物采用链霉素磁珠进行纯化。然后清洗磁珠得到洗脱的蛋白质。（B）RNA契合寡聚物策略依赖于寡聚物-标记的RNA分子和融合到活细胞标签中的壳蛋白的共表达。这些细胞是相互交联的，经过裂解，最终，RNA相关的蛋白通过免疫沉淀法被捕获，采用与壳蛋白融合的标签（左图）。另外，壳蛋白可与邻近标记的酶类相融合，这些酶类，除了和生物素结合外，可标记其邻近的蛋白质。生物素化的蛋白可通过链霉素包裹的磁珠被分离（右图）。（C）基于dCas13的方法的流程图。细胞被dCas13和gRNA所转染。这些gRNA可招募dCas13并将其邻近标记的酶与感兴趣的RNA进行融合。在添加生物素时，邻近标记的酶和对其附近的蛋白进行生物素化。这些蛋白质通过链霉素磁珠进行分离并通过质谱进行鉴别。
2014年，West及其同事描述了一种杂交-捕获的方法，称为RNA靶标的捕获杂交分析（CHART）-MS以研究IncRNAs NEAT1和MALAT1的互作组。一年后，其他3个杂交-捕获技术，称为ChIRP-MS（质谱综合鉴定RNA蛋白），RNA反义链纯化（RAP）-MS，以及直接鉴别与RNA发生互作的蛋白质（iDRiP）被开发出来。有趣的是，3个研究将此策略应用于鉴定Xist的互作组当中(一种与ncRNA相关的在雌性动物细胞中失活X染色体的方法)。令人震惊的是，用这三种方法鉴别出的与Xist互作的蛋白的交集很少，可能是由于方法学上的差异。这包括使用不同的交联试剂，反义的寡核苷酸的数量和大小，以及使用不同的阈值去定义统计学上显著的相互作用的蛋白质分子。这表明试验设计能够显著的影响那种RNA-蛋白质的互作关系可以被鉴别出来。特别是反义的寡聚核苷酸需要被仔细的设计，这样它们才能特异性的针对某一目标RNA及其结合位点。但是，一旦反义的寡聚核苷酸被设计和检测，目标的RNA可不经过遗传学的操作从细胞中被分离，这使得研究者可以从原代细胞系和组织样本中在体内鉴别RNA-蛋白质的互作关系，目前，杂交捕获方法被用于一系列RNAs中RNA-蛋白质互作关系的鉴定。
4.2 RNA标签
一般的RNA-标签-介导的纯化过程包括连接茎环结构，与目标RNA结合，称为适配体（图3B）。这些茎环结构，通常4-24个重复，依靠其相应的RBP/壳蛋白被识别。最为常用的适配体是来自于噬菌体MS2的MS2茎环结构，以其高特异性和亲和力与MS2噬菌体壳蛋白（MS2-CP）结合。在哺乳动物细胞系中，MS2序列并非天然存在，因此，MS2-CPs不能够识别哺乳动物的RNAs。其他适配体-蛋白组合物，比如PP7茎环-PP7壳蛋白以及BoxB茎环-λn多肽，适配体标记的RNA可募集与多肽标签融合的壳蛋白以辅助分离相关的蛋白质。RBP纯化和鉴别的方法（RaPID）采用MS2和MS2-CP之间的互作进行，它们与GFP和链霉素结合的多态标签（SBP）融合；荧光素标签能够使RNA成像，而SBP标签能够纯化RNA相关的蛋白。一些相似的方法，比如体内生物素标记的RNAMS2亲和纯化（MS2-BioTRAP），MS2-标记的RNA亲和纯化（MS2-TRAP），以及MS2-标记的RNA亲和纯化和质谱（MTRAP-MS）也都在相应的文献中进行了介绍。
当设计基于RNA-标签纯化方法时，研究者们需要考虑一些问题。选择高亲和度和特异性的小标签更加有利于避免与壳蛋白的折叠结构之间的干扰，并且更加有利于采用严谨的洗涤方法（例如：采用含有高盐和洗涤液的洗涤缓冲液）去除非特异性的结合，相对于RNA表达水平的壳蛋白表达水平和茎环重复结构的数量对于达到最佳的信噪比是必要的，但多少茎环结构需要达到最佳的壳蛋白的招募尚不清楚，减少茎环结构的数量或者甚至仅适用单个茎环结构对于最小化结构干扰以及内源RBPs的结合是有利的。一些方法报道了采用单个的茎环结构标记RNA分子的方法，Lee及其同事采用单个的可被CRISPR内切酶Csy4识别的发夹序列研究3个miRNAs前体在不同细胞类型中的互作组。这表明单个发夹标记的RNAs的质谱分析方法是可行的。
最近一种不同的策略，成为细胞内蛋白质-RNA互作（incPRINT）被开发出来，这种方法不需要基于质谱的分析。这种方法是基于3中组分的共表达；重组的荧光素酶链接MS2-CP；MS2-标记RNA；FLAG-标记的蛋白质。细胞裂解液采用抗-FLAG磁珠包括置于384孔板中进行免疫共沉淀并且，与发光检测一起，与检测的RNA互作的FLAG标记的蛋白可被鉴别出来。为了系统的鉴别RNA-蛋白质的互作关系，研究者们需要建立一个FLAG-标记的蛋白质文库。作为对概念的证明，小鼠Xist RNA中3个保守区段在~3000个FLAG标记的蛋白中进行查询，鉴别出一个区域特异性的~17kb长的Xist转录本的互作。
4.3 邻近蛋白质租的特定的RNA转录本：基于适配体的方法
进一步的基于适配体的方法主要通过将壳蛋白与这些酶进行融合而募集邻近标记的酶到茎环结构的RNAs上。邻近标记的酶可对其能够接触到的赖氨酸或者酪氨酸在10-20nm的半径内进行生物素化，最常用的酶是APEX和BioID（一种BirA的任意突变体）。基于邻近生物素化的优点包括对弱的以及瞬时的互作和可溶性蛋白质的捕获，这是因为生物素化在活细胞中发生；此外，由于生物素和链霉素磁珠之间的强亲和力，APEX2也能够标记RNA，使得能够鉴别出与感兴趣RNA发生互作的蛋白质和RNAs。另外，具有较快标记时间的生物素标记的酶类，比如APEX2和（mini）TurboID，能够支持长时间的研究RNA-蛋白质互作的动力学，但是，邻近生物素标记法也有一些局限性，这在后面要进行讨论（见“特定RNA转录本邻近的蛋白质组”：未来的发展方向）。
Ramanathan及其同事开发出了RNA-蛋白质互作检测法（RaPID），包括BoxB茎环标记的RNA和与生物素连接酶类BirA*或者BASU相融合的λN多肽。RaPID-western被应用于证实一种已知的RNA-蛋白质互作，UDEN15UG-富含RNA的序列以及CELF1。即使这些方法不能直接进行比较，但与传统的RNA亲和纯化法相比，RaPID-western显示出显著的富含与UDEN15结合的CELF1。其他方法融合MS2-CP和APEX2以鉴别与人类端粒酶RNA互作的一些蛋白，这些研究对过表达的标签RNAs而非内源性的RNA进行了调查。但是，最近RNA-BioID被用于研究内源性标签的β-actinRNA互作组，而只有少量的研究聚焦于内源性的互作可能有两个原因：首先，内源性标签富有挑战性；其次，大多数转录本的RNA丰度太低以至于不能提供足够的富集。
4.4 特定RNA转录本的邻近蛋白组：基于CRISPR的方法
CRISPR-Cas13RNA靶标系统的发现（框图1）提供了为感兴趣RNA转录本募集邻近标签酶类的新的机会。新的方法学被应用于几个研究组中，Zhang及其同事开发出了一种基于CRISPR的RNA-联合的互作系统（CRUIS），是基于dCas13a与邻近标签酶PUP-IT融合。CRUIS被用于鉴别内源性lncRNA NORAD和p21 mRNA的互作组，而Yi及其同事开发出了CRISPR辅助的RNA-蛋白质互作检测方法（CARPID）以通过募集dCas13d-BASU检测Xist，DANCER和MALAT1之间的互作的方法。虽然这些研究都是基于相同的原理，其核心的差异是明显的，比如靶标是内源或外源的RNAs，靶标RNA的表达水平，以及dCas13亚型与相邻近标签酶类的联合。虽然第一个研究使用了CRISPR- Cas13RNA靶标系统去鉴别与特定RNA转录本互作的蛋白质是非常有前景的，更多的针对该系统的分子机制的见解是需要的，例如，设计有效的gRNA仍然是富有挑战性的，因为靶标的识别需求目前仍未被完全理解，并且仅有少数几个工具可被用于预测gRNA的有效性。
图4 对于邻近基于标记的RNA-蛋白质鉴定的优化
使用分裂的邻近标记酶（A-C）使得信噪比更优化（SNR）。（A）例如，通过在感兴趣的RNA分子中结合两个不同的茎环结构，一种完美的邻近标记酶仅在与靶标RNA结合时进行装配。（B）另一种选择是向被发夹结合蛋白识别的细胞中传递两种gRNA（例如：dCas13b和dCas13d）每一种都与邻近标记的酶进行融合，这些gRNA被间隔一定距离以允许二聚化。（C）另一种方法，连接酶的活性可通过结合在化学诱导物进行二聚化下的分裂-蛋白质策略进行重塑。为靶标RNA募集更多的生物素连接酶也能提高SNR（D,E）。这可以通过（D）表达包含适配体的，可以募集与邻近标记的酶融合的壳蛋白的gRNA来实现。（E）在Sun标签系统中，dCas13可与蛋白质阵列相融合，可以募集多个scFV邻近的标签酶类。（F）制造较小的可以靶向结合感兴趣RNA的蛋白质可能导致对其他RBPs较少的干扰。
5. 特定RNA转录本的邻近蛋白质组：未来的发展方向
依赖邻近生物素化方法的主要挑战，不论是适配体法或者基于Cas13的方法，是提高信噪比。邻近标记酶可辅助邻近蛋白的生物素化，即使不与靶标RNA相结合，也导致了非特异性蛋白的生物素化。为了克服这些局限性，在靶标RNA分子中恢复邻近标记酶的活性可能是一种很有前景的策略，邻近标记酶的每一半都可与不同的壳蛋白进行融合，融合发生在当与插入靶标RNA的与其同源的茎环结构进行结合时（图4A）；另一种方法是采用两种可被不同的发夹结合蛋白识别的gRNAs，每一种都可与邻近标记酶的一半进行融合，融合之处gRNAs被间隔特定的距离以允许其二聚化（图4B）；还有一种方法对于邻近靶标RNA的重塑可能可通过结合杂合二聚体的化学诱导分子来裂解蛋白的策略来实现（图4C）。针对APEX2，TurboID，和BioID的裂解酶类已经被开发出来，使得采用当前的方法研究RNA-蛋白质的互作关系成为可能。
此外，增加邻近标记酶的数量能够提高信噪比。正如研究者在Cas9中所证实的，采用额外的适配体设计gRNAs在为多个靶标位点招募多个效应因子蛋白，因此提高了基因编辑的效率。最近，Zhao及其同事整合了两个MS2茎环结构到Cas13 gRNA以招募转甲基酶，使得m6A编辑是有效的（图4D）；另一个建议是使用Sun标签技术招募多个邻近标记的酶结合到单个的dCas13蛋白上（图4E）。Suntag能够结合dCas9，但是并不与dCas13结合，并且可提高基因组位点的成像，以及基因的激活和抑制。总之，这些以及其他方式可提高信噪比。
Cas13蛋白是相当大的蛋白质（~100-140kDa），这可能影响了与内源性RBPs与Cas13靶标RNA分子的结合。因此，较小的RNA靶标系统可能是更加有益的（图4F），诸如CRISPR/Cas-RNA靶标系统（CIRTS，~25kDa）。CIRTS系统与Cas13相似，一种gRNA依赖的RNA靶标系统可以辅助开发更加强有力的方法去综合的鉴别特定RNA转录本的互作组。
6. 结语
总之，各种以RNA为中心的方法研究已知RNA转录本的蛋白质组，产生了RNA生物学的新观点。最近的基于dCas13的方法将辅助鉴别特定RNA转录本的互作组，甚至是以高通量的方式。这可被用于，例如，定位结合感兴趣的全长RNA转录本的蛋白质；此外，结合以RNA为中心的方法以及其他互补方法去证实鉴别出的互作蛋白质以及获取对RNA生物学更深刻的认识。甚至通过研究RNA-RNA互作，RNA-DNA互作或者RNA-染色质互作获得更多的RNA互作复杂性的观点。
由于RNA分子在疾病中发挥的中心作用，RNA-蛋白质的互作被认为是治疗的一种很有吸引力的靶标。例如，一些小分子已经被开发出来作为HIV中转录过程的反式作用因子（TAT）以及反式作用因子响应RNA（TAR）的靶标分子，而有关RNA-蛋白质的互作的知识可被用于设计用于各种目的的蛋白质，包括RNA降解，编辑，或者成像方面的蛋白质。因此，进一步的技术发展和运用去鉴别RNA-蛋白质的互作可能具有深刻的影响，不仅仅从基础方面，也从应用科学的角度。