科研| J HEPATOL：代谢途径分析发现脯氨酸生物合成途径促进肝肿瘤发生
编译：胜寒，编辑：谢衣、江舜尧。
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论文ID
原名：Metabolic pathway analyses identify proline biosynthesis pathway as
a promoter of liver tumorigenesis
译名：代谢途径分析发现脯氨酸生物合成途径促进肝肿瘤发生
期刊：Journal of hepatology
IF： 18.946
发表时间：2019.10
通讯作者：韩卫平
通讯作者单位：新加坡生物成像中心；新加坡分子与细胞生物学研究所
实验设计
实验结果
在HCC模型中脯氨酸代谢发生了改变，但在再生肝组织中没有变化
通过对DEN和MH3924a肿瘤进行转录组分析，作者发现肝脏肿瘤在各种代谢途径中均表现出变化。重要的是，在再生组织中未观察到这些变化，这表明它们不仅与普通增殖有关，而且对肿瘤发生具有一定程度的特异性。为了确定潜在的治疗靶点，作者根据表达的差异列出了最主要的KEGG途径内的基因（图1A）。
在HCC模型中，磷酸甘油酸脱氢酶(phospho - glycerate dehydrogenase, PHGDH)和磷酸丝氨酸氨基转移酶1 (phosphoserine aminotransferase 1, PSAT1)被认为是上调最多的基因，这与之前的报道一致，即丝氨酸和甘氨酸代谢在癌形成中发挥了重要作用，并提示它们在HCC中可能具有类似的作用。尽管PHGDH和Psat1在大鼠MH3924a细胞中的shRNA KD导致了细胞增殖的减少，但PHGDH和PSAT1的缺失对人肝癌细胞株Hep3B和Huh7的增殖没有影响。此外，对肿瘤基因组图谱(TCGA)-肝细胞癌(LIHC)队列的分析表明，肿瘤中PHGDH和PSAT1的表达实际上是下降的，并不能很好地预测临床结果。因此，虽然PSAT1或PHGDH可能需要进一步的研究，但作者认为它们可能不是治疗干预的最佳靶点，并决定研究列表上的其他基因在影响肝癌发生中的潜在作用。
脱氢酶1（Prodh）催化脯氨酸的降解，而Pycr1促进脯氨酸的合成（图1A，B）。在HCC模型中，脯氨酸减少了约4倍，Pycr1增加了3到4倍，这与脯氨酸生物合成的总体增加相一致（图1A）。表达的变化通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法进行了证实（图1C，D）。尽管对照肝组织几乎没有检测到Pycr1 mRNA或蛋白质的水平，但作者观察到在所有测试的肿瘤组织中Pycr1 mRNA表达显着增加（小鼠约为15倍，大鼠肿瘤约为25至30倍），相应地，所有小鼠和大鼠肿瘤中PYCR1蛋白的水平增加。相反，相对于非肿瘤肝组织，肿瘤显示出Prodh mRNA和蛋白质的明显下调（图1C，D）。为了确定表达变化是否影响酶活性和代谢产物水平，作者测量了来自不同肿瘤模型的样品中脯氨酸的浓度。 大鼠DEN和MH3924a肝癌的肿瘤样品均显示脯氨酸水平明显高于其对照（图1E）。与之一致，与对照相比，小鼠DEN肿瘤样品中脯氨酸的含量也呈上升趋势（图1E）。综上所述，这些数据表明参与脯氨酸代谢的酶Pycr1和Prodh在肿瘤中发生了改变，从而促进了脯氨酸的生物合成。
图1 HCC模型中脯氨酸代谢异常
PYCR1 KD限制体外HCC细胞增殖和体内肿瘤生长
为了进一步研究脯氨酸代谢在HCC肿瘤发生中的作用，作者首先关注上调的基因PYCR1。 与动物肿瘤模型一致，在许多人类HCC细胞系（包括Huh7，Hep3B，HepG2，SNU-398和SNU-449）中观察到PYCR1的高水平表达，而在正常肝组织和非致瘤的永生化HaCat细胞系中的表达则较低（图2A）。接下来，作者使用3个靶向PYCR1的序列和一个非靶向对照构建体，通过shRNA介导的基因KD评估了PYCR1的功能作用。 用携带shRNA和对照序列的慢病毒构建体感染了多种HCC细胞株，并通过蛋白质印迹评估了KD效率（图2B）。PYCR1的敲除显着降低了所有测试的HCC细胞系的细胞增殖（图2C）。相反，PYCR1的KD不会影响非致瘤HaCaT细胞的增殖。接下来，作者通过皮下注射Pycr1 KD或对照MH3924a细胞到SCID小鼠中（图2D），以及从原位到ACI大鼠的肝脏中（图2E）来进行异种移植实验。与体外研究一致，在两种异种移植模型中，与对照细胞相比，PYCR1敲除后导致肿瘤明显缩小（图2D，E）。为了验证，作者还构建了多四环素（Dox）诱导的PYCR1 KD细胞系。 Western blots证实了Dox诱导的KD的功效，并且与组成型shRNA一致，Dox诱导的PYCR1 KD细胞显示出细胞增殖的减少（图2F）。为确保对细胞增殖的影响对PYCR1敲除具有特异性，作者还重新引入了PYCR1在Dox诱导的Hep3B KD和组成型Huh7 KD细胞中的表达。如预期的那样，PYCR1的重新表达拯救了两个KD细胞的增殖（图2G）。KD后细胞数量减少可能是由于凋亡增加所致，根据裂解的caspase-3水平，作者没有发现这方面的证据。考虑到PYCR1 KD导致几种HCC细胞系增殖减少，作者检查了过表达的PYCR1（高于基线水平）是否足以增强增殖。实际上，PyCR1在Hep3B和Huh7细胞中的过表达导致明显更高的增殖率。相反，PYCR1过表达对来自小鼠（AML12）和人（THLE2）细胞系或HaCat细胞系的永生化非致瘤肝细胞增殖没有显着影响。综上所述，这些数据表明PYCR1对于体外和体内致瘤细胞系的增殖是必需的，而不影响正常和非致瘤细胞的增殖或生存力。这表明PYCR1可能是某些癌症的潜在治疗靶标。
图2 PYCR1对癌细胞增殖至关重要
PYCR1而不是PYCR2，调节HCC细胞的增殖
图3 敲除PYCR1或PYCR2的Hep3B细胞的基因表达特征
通过添加的脯氨酸生物合成酶调控HCC细胞的增殖
图4 ALDH18A1调节癌细胞增殖
PYCR1 KD导致代谢编程改变，有利于减少增殖
考虑到干扰脯氨酸代谢可能导致的代谢后果，以及这可能与PYCR1介导的细胞增殖调控有关，作者对3个独立细胞系Hep3B、Huh7和MH3924a中的对照和PYCR1 KD细胞进行了非靶向的全面代谢组学筛选。在275个被检测的代谢物中，13个(3个上调，10个下调)在所有3个细胞系的KD细胞中存在显著差异(图5A)。值得注意的是，其中包括多种溶血磷脂的减少，以及碳水化合物利比醇和山梨醇的减少。为了更好地理解通路水平上的代谢变化，作者考虑了至少在2个细胞系中存在显著差异的代谢物，而在第三个细胞系中存在相反方向上不存在显著差异的代谢物。这79种代谢物的扩展列表确定了许多额外的碳水化合物和核苷酸前体，这些前体在KD细胞中普遍较低(图5B)。在休息和增殖细胞中，葡萄糖有多种命运，包括流入多元醇、己糖胺生物合成、糖酵解和戊糖磷酸途径(图5C)。特别是戊糖代谢对提供核苷酸合成的前体至关重要，而许多癌细胞利用好氧糖酵解来产生能量和生物量来产生新细胞。PYCR1 KD不仅表现出较低水平的核苷酸和核苷酸前体，而且乳酸含量下降，表明通过这些途径的通量有限。为了进一步探究这些发现，作者使用海马XF24分析仪检测了对照和PYCR1 KD细胞中的糖酵解活性。与代谢组学数据一致，KD导致Hep3B和Huh7细胞的糖酵解基线水平显著降低，总糖酵解能力降低(图5D)。虽然脯氨酸或其直接代谢物没有转化为糖酵解或戊糖代谢，但这些途径中的许多反应都需要NAD+和NADP+。值得注意的是，PYCR1和ALDH18A1催化的反应产生NADP+，破坏谷氨酸-脯氨酸生物合成通量可能会干扰NADP+的产生和NADP+/NADPH的平衡。事实上，尽管NADP+/NADPH的比值没有改变，但PYCR1 KD显著降低了NADP+和NADPH的水平(图5E,F)。补充NADP +可以部分挽救PYCR1 KD细胞增殖的降低（图5G）。这些数据表明脯氨酸生物合成酶可能通过产生NADP +来影响糖酵解和戊糖磷酸途径。这些途径对于核苷酸生物合成和乙酰辅酶A的生产至关重要，这促进了TCA循环和脂肪酸生物合成。综上所述，这些数据表明PYCR1 KD会导致一种限制细胞增殖的代谢状态。
图5 PYCR1 KD干扰NADP+依赖的碳水化合物代谢
脯氨酸代谢在肝癌中发生改变，并与患者预后相关
最后，为了描述人原发性肝癌的脯氨酸生物合成途径，作者检测了来自新加坡的55个匹配的HCC和邻近的正常肝组织样本的基因表达谱。与动物模型和细胞系研究一致，通过谷氨酸(PYCR1, ALDH18A1)参与脯氨酸生物合成的酶被上调，而通过精氨酸途径分解代谢酶PRODH和其他酶被下调(图6A)。在TCGA HCC队列中观察到几乎相同的表达模式，证实了这些变化在来自不同背景的队列中是一致的。作者使用独立的石蜡包埋的HCC/邻近正常组织组(n = 16)，对PYCR1进行免疫组化检测。与mRNA表达一致，在肿瘤组织中容易检测到高蛋白水平，但在邻近的正常组织中不容易检测到(图6B)，在非肿瘤和肿瘤样本中组织学评分(H-score)有显著差异(图6C)。这些变化再次在另一组以人类蛋白图谱为特征的HCC样本中得到证实。免疫组织化学分析证实，在mRNA水平上观察到的脯氨酸代谢酶的变化也在蛋白水平上观察到。有趣的是，作者注意到许多脯氨酸代谢酶，尤其是PYCR1、PRODH和ALDH18A1的mRNA表达的变化程度与肿瘤分级相关(图6D)。这表明脯氨酸代谢途径在低分化、侵袭性肿瘤中发生特殊改变。
为了检查肿瘤脯氨酸代谢的变化是否对临床结果有影响，作者分析了TCGA队列中总体生存率的相关性。维持高水平PRODH表达或低水平ALDH18A1或PYCR1表达的患者生存率明显提高（图6E）。即使在调整了患者和肿瘤特征（例如年龄，性别，肿瘤分期，肿瘤等级，放射疗法，处方疗法和其他疗法）后，这些关联中的许多关联仍然显著。这些结果增加了脯氨酸代谢酶的改变赋予肿瘤功能优势的证据，并表明表达水平可以作为疾病严重程度的独立指标和临床结果的预测指标。
图6 在肝癌中脯氨酸代谢酶表达发生改变
讨论
肿瘤可通过上调PYCR1和ALDH18A1表达，同时减少PRODH来实现脯氨酸生物合成的有效增加，这一发现在不同的HCC肿瘤模型以及HCC患者肿瘤样品中均一致。 随着生物合成酶的增加，在分析的3种不同的HCC动物模型中脯氨酸代谢物水平也增加了。显然，在3种不同的HCC模型中，脯氨酸水平与肿瘤生长速度相关:在生长迅速的原位Morris肝癌模型中，脯氨酸水平最高，而在生长缓慢的DEN模型中，脯氨酸水平最低。
脯氨酸代谢在体外增殖细胞中的重要性早在30多年前就已被发现。随后的机制研究主要集中在PRODH及其在活性氧(ROS)相关信号转导中的重要性。PRODH是一种多功能蛋白，在不同的肿瘤条件下，既可以作为肿瘤抑制因子，又可以作为肿瘤生存因子。在此，作者发现在肿瘤样本中PRODH水平降低，并检测了增加PRODH在减缓肿瘤细胞增殖中的潜在治疗作用。令人有些意外的是，PRODH在3个不同的HCC细胞中过表达并不影响它们的增殖，这与在肝癌中靶向PRODH存在争议。最近的研究已经将PYCR1和ALDH18A1的活性与其他对细胞增殖至关重要的代谢途径联系起来，它们依赖于NAD(P)H平衡。作者的代谢组学数据证实了这一模型，表明糖酵解和戊糖磷酸途径的通量在PYCR1 KD后被破坏。除了与PRODH介导的脯氨酸分解代谢相关的抗氧化特性外，值得注意的是，脯氨酸本身具有清除活性氧的活性，可保护细胞免受过多的ROS诱导损伤。不能排除增加脯氨酸生物合成可用于保护肿瘤细胞免于ROS诱导的细胞死亡的可能性，即使在PRODH重新表达后未观察到增殖变化，且HCC细胞系中PYCR1 KD并未导致ROS水平的变化。此外，在细胞培养基中向PYCR1 KD细胞补充过量的脯氨酸并不能挽救其增殖抑制作用。因此，尽管这些过程可能在增殖细胞中发生，但它们似乎不是驱动增殖变化的机制。PYCR1 KD后代谢物的变化表明细胞中NADP + / NADPH的水平可能对肝癌细胞的生长很重要。还需要进一步的研究来最终确定其潜在机制。
葡萄糖和谷氨酰胺都是重要的营养物质，在细胞增殖过程中被迅速吸收。PYCR1 KD导致细胞葡萄糖和中间糖酵解代谢物水平的大幅降低，以及维持细胞增殖所需的其他代谢基础。除了以ɑ-酮戊二酸参与TCA循环外，谷氨酸还可以通过ALDH18A1和PYCR1介导的酶促反应进入脯氨酸生物合成途径。值得注意的是，脯氨酸也可以由鸟氨酸合成。然而，由于介导鸟氨酸与脯氨酸通量的代谢酶被下调，因此，在HCC中，脯氨酸不太可能大部分来源于鸟氨酸。合成脯氨酸的最终命运是什么？ 对肾肿瘤的核糖体进行分析的最新报告表明，在掺入蛋白质的所有氨基酸中，脯氨酸的可用性是限制因素。
总之，作者证明脯氨酸生物合成途径在动物肿瘤模型、HCC细胞系和人类HCC样本中均有上调。脯氨酸代谢相关酶的表达调节影响了肝癌细胞系的体外增殖和体内肿瘤的形成。值得注意的是，非肿瘤肝组织、正常增殖细胞或再生肝组织的PYCR1和ALDH18A1表达水平较低或检测不到。因此，PYCR1和ALDH18A1可能被评估为潜在的癌症药物靶点，并需要在人类肿瘤样本中进行进一步的检测，以及在其他肿瘤模型中进行功能研究。
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.jhep.2019.10.026