编译：寒江雪，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
异丁醇作为生物燃料比乙醇优势更明显，但由于没有合适的底物来处理和其溶剂毒性，因此在商业上仍然不可行。本研究选择了乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），它有较强的耐受环境压力的能力，在连续搅拌槽反应器（CSTR）中进行适应性实验室进化（ALE），以进化出一株耐异丁醇的菌株。该菌株在培养60天以上（>250代），同时逐渐提高选择压力，即异丁醇的浓度。扫描电子显微镜（SEM）研究和膜电位分析显示细胞形态发生微小变化，但这导致了对异丁醇耐受性极高的菌株的进化。为了确认菌株完整性，全基因组测序也显示进化菌株中突变较少。突变在转录组中变化显著，涉及膜转运、氨基酸代谢、糖摄取和细胞壁合成等基因表达水平发生了显著改变。分析导致异丁醇耐受复杂表型的这些变化的协同效应，有助于构建更好的异丁醇生产宿主平台。
原名：Genomics and transcriptomics analysis reveals the mechanism of isobutanol tolerance of a laboratory evolved Lactococcus lactis strain
译名：基因组学和转录组学分析揭示实验室进化的乳酸乳球菌株对异丁醇的耐受机制
期刊：Scientific Reports
IF：3.998
发表时间：2020.7
通讯作者：Jaya A. Gupta
通讯作者单位：尼赫鲁大学生物技术学院
本研究选择了乳酸乳球菌通过在连续搅拌槽反应器（CSTR）中进行适应性实验室进化（ALE），得到异丁醇耐受菌株。通过扫描电镜和膜电位分析突变菌株与野生型在形态和膜电位的差异。利用基因组和转录组测序，比较突变菌株与野生型的突变位点及差异表达基因，从而探究导致异丁醇耐受的分子机制。
1 提高异丁醇耐受性的实验室适应性进化
研究人员将天然乳酸菌NZ9000菌株在不同浓度（0–20 g/L）异丁醇下的生长速度，以确定其耐受水平。随着异丁醇浓度的增加，最终生物量产量和比增长率下降，当浓度大于8g/L时，生物量产量和比增长率急剧下降。在20 g/L异丁醇下，生长完全停止（图1A）。因此在进料中设置8 g/L异丁醇的初始浓度。通过OD值可观测细胞在此期间经历的多轮适应性进化（图1B）。在第一轮中，当异丁醇浓度在9天内逐渐增加到28 g/L时，细胞迅速适应，生物反应器中的生物量浓度保持恒定。当浓度增加到28 g/L以上时，生物量急剧下降，生长几乎完全停止。此时暂时停止投料，以使已经出现的耐受细胞在培养基中占优势。在本实验中，进料速率和异丁醇浓度的增加是逐渐增加的，所以可以适应进化的速率。一旦出现一种能耐受饲料中异丁醇水平的表型，它就可以在特定浓度的异丁醇下正常生长。然而，随着异丁醇浓度的进一步增加，出现了冲刷现象，必须停止喂食，以出现更好、更具抗药性的表型。这种停-启程序重复多次，在两个月内将耐受性慢慢提高到40 g/L。在这段时间里，CSTR连续运行，并短暂停止，以便恢复生物质。
图1 A静态瓶中生长速率。B CSTR中的自适应实验室进化。
2 菌株完整性检测
“菌株完整性”意味着连续搅拌槽反应器中的细胞群没有被其他菌株污染或替代。物种特异性PCR仍然是确认菌株遗传完整性的金标准。从所选（28 g/L和40 g/L）异丁醇进化菌株以及天然NZ9000（阳性对照）和大肠杆菌基因组DNA（阴性对照）中获得的PCR产物。阴性对照中没有扩增证明引物对乳酸乳杆菌16srRNA有特异性，在试验样品中我们检测到一个163 bp的产物对乳酸乳杆菌亚种有特异性。证实了在高异丁醇浓度下生长在CSTR中的菌株确实是乳酸乳杆菌。
3 40g/L异丁醇进化株的基因组序列分析
为了确定菌株的基因型，确定导致异丁醇耐受性增强的突变，对40g/L异丁醇进化菌株的基因组进行了测序。与已发表的NZ9000基因组序列进行比较，我们可以识别表1中列出的所有突变。大多数SNP发生在蛋白质编码区，但也观察到三种基因间突变。基因组测序也证实进化出的耐异丁醇菌株确实是乳酸乳杆菌。
表1在40 g / L异丁醇进化菌株中鉴定出的突变。
4 突变菌株稳定性分析
选择了三株能耐受异丁醇浓度增加的菌株（23 g/L、30 g/L和40 g/L），并通过在没有异丁醇的情况下初步培养来检验稳定性。首先在没有异丁醇的培养基中分离12-16代的单个细胞，培养过夜。用隔夜原代培养物接种含有不同浓度异丁醇的二次培养物，并监测生长速度。这一过程消除了超过16-18代的选择压力，随后监测细胞在异丁醇存在下的生长能力。以为突变的野生型作为对照，这些细胞保持耐受表型，并且在高异丁醇浓度下生长良好，在逐渐升高的异丁醇浓度下，最具耐受性的菌株的生长下降最少（表2）。在24 g / L异丁醇条件培养，30 g / L异丁醇进化菌株的最大比生长率始终优于40 g / L异丁醇进化菌株。这种菌株在更高浓度的异丁醇存在下生长的能力可以通过重组实现，这会影响其最佳性能，而且该菌株也会携带相应数量的突变。
表2不同比例异丁醇GM17培养基中NZ9000和异丁醇进化菌株的最大比生长速率（μmax）h−1。
5 细胞形态扫描电镜分析
接下来是从细胞形态上找到耐受性提高的原因。细胞壁或细胞膜结构的表面变化是抵御环境压力的第一道防线。研究人员通过扫描电镜来观察对抗异丁醇过程中细胞表面形态和大小的变化。40g/L异丁醇耐受菌株的大小比没有异丁醇的情况下生长增加了约19%（并且比球菌更具杆状），但与NZ9000相比没有明显偏差（图2A和B）。说明异丁醇毒性对细胞分裂机制基因有影响。
图2 A扫描电镜图片。B扫描电镜图像计算的平均细胞大小。
6 膜电位分析
早期研究发现膜电位调节一些保守的细胞分裂蛋白的分布，如MinD、FtsA和细菌细胞骨架蛋白MreB。同时在养分转运过程中也起着重要作用。通过比较进化菌株和野生型由于去极化和超极化引起的DiSC3荧光变化（图3）。质子动力（PMF）由ΔpH和ΔΨ组成。从所观察到的染料荧光模式的差异，我们可以推断野生型和异丁醇进化型细胞之间ΔΨ变化的幅度只有轻微的差别。综合结果分析发现膜电位的变化不足以成为异丁醇耐受性演变的主要因素。
图3 DiSC3荧光示踪显示膜电位。
7 40g/L异丁醇进化菌株的转录组学分析
本研究可作为通过逆向工程设计异丁醇耐受表型的有用指南。以NZ9000为对照，分析了在异丁醇存在和不存在条件下生长的异丁醇进化菌株的转录谱。通过FPKM值表示转录本丰度。与WT相比，4B0培养基（40 g/L异丁醇进化菌株）有578个差异表达基因。调控区域的突变一定引发了一连串的事件，导致了进化菌株转录组的急剧变化。选择一些差异基因通过RT-qPCR验证其表达模式，结果与转录组一致（表3）。大部分上调和下调的基因属于未知途径，因此很难得出确切的结论。如果只关注已知的途径，前100个上调基因中有相当一部分属于氨基酸代谢和膜转运途径，而前100个下调基因中有很大一部分是翻译和碳水化合物代谢（表4和5）。说明异丁醇耐受与一系列途径的基因表达水平的变化有关。同样也观察到有很多转录因子的差异表达，这可能是导致多个下游基因表达变化的原因。例如CodY转录抑制因子（LLNZ_00910）调控氮代谢，如参与氨基酸生物合成和与氮供应相关功能的蛋白质，在4B0培养基中显著下调。一些受CodY下调影响的基因，如精氨酸琥珀酸合成酶、ABC型寡肽转运系统、二氢二苯丙酸还原酶等基因均显著上调（表6）。参与酚酸化合物解毒所需基因调节的PadR转录调节因子（LLNZ_01700）上调。另一个与多种抗生素的耐药性有关的转录因子MarR也表现为上调。TetR转录调节因子（LLNZ_01285）控制外排泵和转运体的调节，这些转运体参与抗生素耐药性和对有毒化学物质的耐受性也被上调。在这些转录因子调控下的许多基因转录物也被上调（图4）。耐受表型的进化是全基因组调控机制发生变化的结果，对多个下游基因产生连锁效应。细胞分裂机制基因的表达也发生了改变（表7）。这与在扫描电镜下观察到的4B0细胞的形状改变和大小增加有关。杆状决定蛋白MreD（LLNZ_12955）表达增加（logFC=3.4）与观察到的4B0细胞形状变化相关。细胞变大的一个优点是降低了表面积与体积比，这将有助于对抗异丁醇的毒性。通常在正常细胞中活跃的天然糖转运系统成分纤维二糖特异性磷酸转移酶系统（TPS）中多个基因下调，而其他纤维二糖特异性PTS系统IIC成分则被上调。当细胞在许多天然的吸收途径由于异丁醇胁迫而被下调的条件下生长时，细胞已经重新规划了其糖摄取机制。而且，这种应激反应在某种程度上已经变成了结构性的，因为进化的细胞甚至在没有异丁醇的情况下也在使用这些替代途径。
表3从RNA-seq和RT-qPCR计算转录本的相对变化。
表4在4B0培养基中基因的上调基因。
表5在4B0培养基中基因的下调基因。
表6 CodY转录抑制因子调控的基因转录，在4B0培养中由于CodY下调而上调。
表7 4B0培养中参与细胞分裂机制的下调基因。
图4 PadR、MarR和TetR家族转录调控基因。
8 预测个体基因组突变对转录组的影响，从而提高异丁醇耐受性
尽管基因组测序显示了突变较少，但RNA序列分析显示进化菌株在转录水平上发生了较大变化。因此，有必要分析其中关系以及它如何最终导致这种耐受表型的出现。在LysR家族转录调节因子上游有一个突变，该家族控制着一个大家族的原核调节蛋白，其中包括CysB和MetR调节因子。这些与硫代谢基因的调节有关，并且在进化菌株中被发现显著上调。参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢的O-乙酰高丝氨酸巯基酶基因（LLNZ U 00455）是进化菌株转录组中上调第4高的基因。这种氨基酸途径的上调，特别是半胱氨酸和蛋氨酸代谢的上调，以及LysR转录调节器上游的基因变化，可能与提高耐受性有关。本研究在突变菌株中在LysR家族转录因子上游区域发现点突变（表1），对19 g/L、25 g/L和32 g/L异丁醇进化株基因组DNA进行PCR产物测序。结果显示，上述进化菌株的测序PCR产物中没有点突变。因此40g/L异丁醇进化株的突变对LysR来说确实是特异的，还需要更多的实验来证实这种突变是导致这种耐受表型的原因之一。在ATP酶基因上游有一个可变碱基，P型（转运）超家族，亚家族IC（LLNZ U 13125），其作用很难被破译，然而在4B0培养中，该基因的转录本上调。这个转运子超家族的成员催化阳离子摄取和/或流出。另一个突变（插入）观察到磷酸葡萄糖胺变位酶基因上游（参与肽聚糖生物合成），在4B4培养中也显示上调。然而，这种反应明显是由异丁醇诱导的，因为同一基因在4B0培养中被发现双重下调。这表明异丁醇的存在触发了进化菌株细胞壁合成途径的上调。这种插入导致假基因通过移码突变恢复为与乳酸乳杆菌YbbR蛋白序列相似的多肽。YbbR在已知的金黄色葡萄球菌中具有抗酸性的作用。在其他细菌中发现YbbR与其下游基因磷酸葡萄糖胺变位酶的相互作用。因此，这两个事件的结合，即突变和转录应激反应的变化，说明了这种变化对提高异丁醇耐受性的重要性。
9 添加氨基酸对野生型乳酸菌NZ9000及其进化株生长的影响
基因组测序和转录组学提供的信息，重点研究上调最显著的调控类别上，即氨基酸生物合成途径。早期的研究显示乙醇耐受性和特定氨基酸之间存在联系。因此，研究人员研究添加氨基酸（每种5毫米）对提高野生型NZ9000菌株的异丁醇耐受性的影响，在氨基酸存在下生物量的增加表明细胞有能力应对异丁醇毒性。根据RNA序列数据中的基因表达谱选择氨基酸组合，对40g/L异丁醇进化菌株进行了类似的研究，以监测其在外源添加氨基酸的情况下耐受异丁醇的能力。采取两种策略添加异丁醇：第一种策略是在指数中期添加异丁醇，而在第二种策略，在接种后立即添加异丁醇。发现当培养基中添加氨基酸混合物时，野生型细胞在异丁醇存在下生长的能力得到提高。证实了氨基酸在保护细胞中的作用，并使其即使在有毒有机溶剂的存在下也能繁殖。最终达到的生物量浓度取决于异丁醇的添加策略，早期添加异丁醇不利于生长。因此细胞的代谢状态起着重要作用，活跃生长的细胞对异丁醇的耐受性要好于滞后期的细胞。进化的菌株也观察到了类似的趋势，说明40µg/L异丁醇进化菌株中氨基酸生物合成途径的上调是耐受性的一个重要因素。本研究在连续搅拌釜式反应器中对菌株进行进化，得到异丁醇耐受突变菌株。对40g/L异丁醇耐受菌株进行基因组和转录组测序分析，全基因组测序也显示进化菌株中突变较少，突变在转录组中变化显著，涉及膜转运、氨基酸代谢、糖摄取和细胞壁合成等基因表达水平发生了显著改变。同时通过添加氨基酸发现其是突变菌株异丁醇耐受性的一个重要因素。本研究采用CSTR方式进化菌株，防止有益突变的丢失。通过累积的突变的相加效应最终导致了超耐受菌株的产生。测序发现野生菌株与突变菌株基因组突变较少而转录水平差异较大说明调控区的突变引发一系列基因表达发生改变以适应高浓度异丁醇。本研究为提高异丁醇耐受性在形态和分子机制两方面都提供了有价值的参考信息。
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