科研│湖北大学：多组学联合分析运动发酵单胞菌耐酸性突变株的选育与鉴定（国人佳作）
编译：微科盟 寒江雪，编辑：微科盟景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
酸预处理是一种常用的分解木质纤维素生物质中的半纤维素成分以释放戊糖的方法，而随后通过酶解释放己糖。水解产物经预处理和酶解后，同时含有己糖和戊糖，可作为生化生产的底物。酸预处理后的溶液也可直接作为微生物发酵的底物，其pH为酸性，且含有预处理过程中产生的抑制性化合物。天然产乙醇菌运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）能在pH 3.5~7.5范围内生长，但在pH 4.0以下的酸性条件下，细胞生长和乙醇发酵受到影响。
本研究采用适应性实验室进化(ALE)策略来适应酸性-pH条件下的运动发酵单胞菌种。筛选出两株耐酸性较强的突变菌株3.6M和3.5M，3.5M在酸性pH条件下生长优于ZM4，但低于3.6M，可作为3.6M~ZM4之间的过度菌株，有助于揭示其耐酸性机制。突变株3.5M和3.6M在pH3.8时生长速度比野生型ZM4提高50~130%，消耗葡萄糖的发酵时间缩短4~9h，乙醇产量提高20~63%。利用高通量测序的全基因组重测序（WGR）和转录组测序（RNA-seq）揭示突变菌株对酸性pH的耐受机制。WGR结果表明，与野生型ZM4相比，3.5M和3.6M分别有7个和5个单核苷酸多态性(SNP)，其中4个SNP是在两个突变株中共有的。RNA-Seq结果表明，糖酵解相关基因的上调、鞭毛和运动相关基因的下调有助于细胞能量的生成和重新活化以抵抗酸性pH，同时保持了Z.mobilis的正常生物学过程。此外，与ZM4相比，在酸性-pH条件下突变株的RND外排泵、ATP结合盒(ABC)转运体、质子消耗和碱性代谢产物产生相关基因均显著上调，有助于维持突变株的pH稳态，有助于维持突变菌株的pH动态平衡。在突变体3.6M中，编码F1F0 ATP酶的基因在pH3.8的条件下比在pH 6.2的条件上调，以将多余的质子泵出细胞。这种差异有助于突变体3.6M比ZM4和3.5M更好地适应酸性条件。编码细胞色素bc1复合体的ZMO0956-ZMO0958和编码RND外排泵的ZMO1428-ZMO1432两个操纵子在穿梭质粒中的表达可以帮助Z.mobilis耐受酸性pH条件。
本研究获得的耐酸性pH突变株3.6M可在酸性发酵条件下用于工业化生产生物乙醇。此外，进一步提出了Z.mobilis耐酸性的分子机制，为今后合理设计具有更强耐酸性的合成微生物奠定了基础。此外，本研究提出的结合ALE、基因组重测序、RNA-seq和经典遗传学方法进行突变进化和特征分析的策略也可应用于其他工业微生物。
论文ID
原名：Development and characterization of acidic-pH-tolerant mutants of Zymomonas mobilis through adaptation and next-generation sequencing-based genome resequencing and RNA-Seq
译名：基于基因组重测序和RNA-Seq的运动发酵单胞菌耐酸性突变株的选育与鉴定
期刊：Biotechnol Biofuels
IF：4.815
发表时间：2020年8月
通讯作者：杨世辉
通讯作者单位：湖北大学生命科学学院
DOI号：10.1186/s13068-020-01781-1
实验设计
结果
1 利用适应性实验室进化(ALE)技术选育运动发酵单胞菌耐酸性突变体
Z.mobilis能够在pH 3.5~7.5范围内生长，本研究进一步研究了Z.mobilis在pH 4.0以下的生长情况。结果表明，ZM4能在pH4.0以下生长，当pH值从4.0降到3.5时，滞后期较长，生物量较低（图1）。由于酸性pH条件下细胞膜结构和蛋白质构型的破坏，在pH3.5条件下细胞几乎不能生长。因此，酸性发酵条件下耐酸性菌株的选育将直接有利于生物乙醇的工业化生产。
在RMG2培养基中进行了两个平行的适应性实验室进化(ALE)实验，首先在pH 4.0的条件下培养30代，分别转移到pH3.5和pH3.6下进行耐酸性进化(图2A)。在pH3.5和3.6时，经过55和75代培养，获得了4株耐酸性增强的突变体，分别命名为3.5M-1、3.5M-2、3.6M-1和3.6M-2。在pH3.6下，分析这四个适应突变体的稳定性，每个突变体选三个菌落作为重复。3.5M-1和3.6M-1的后代比3.5M-2和3.6M-2的后代生长更均匀（图2b）。进一步比较这4株突变体与野生型ZM4在不同pH条件(pH3.5、pH3.6、pH4.0和pH6.0)下的生长情况（图3）。
在pH3.5的条件下（图3a），4个突变体的生长速率和最终OD600值均高于ZM4，其中突变体3.6M-1的细胞生长OD600值最高，其次是3.6M-2、3.5M-2和3.5M-1。在pH3.6条件下，突变体的生长速度比ZM4高，达到稳定期的时间比ZM4短（图3b）。与ZM4相比，突变体没有明显的劣势，只是3.5M-1在pH4.0和pH6.0下的最终OD600值都较低（图3c和d）。这些结果表明虽然所有突变体在酸性条件下都有较强的耐受性，但表现各不相同。为了解其耐酸性的分子机理，选择了与ZM4生长不同的两个突变体3.5M-1和3.6M-1，分别改名为3.5M和3.6M进行进一步研究。在酸性条件下，3.6M-1是所有突变体和野生型ZM4中OD600值最高的耐酸性突变体。另一株耐酸性突变株3.5M-1，在pH 3.5时比ZM4生长好，在各种条件下与3.6M-1相差最大（图3）。
图1.野生型ZM4在不同pH条件下的细胞生长情况。
图2.在RMG2培养基上通过适应性实验室进化(ALE)获得ZM4耐酸性突变体的工作流程(a)，以及在pH3.6培养条件下具有稳定耐酸性突变体的验证和筛选(b)。
图3. 4株突变菌株3.5M-1、3.5M-2、3.6M-1和3.6M-2的耐酸性突变株和野生型ZM4在pH3.5(a)、pH3.6(b)、pH4.0(c)和pH6.0(d)的RMG2中生长情况。
2 评价突变菌株3.5M和3.6M在酸性和中性条件下细胞生长、葡萄糖消耗和乙醇生产情况
由于酸性条件会影响细胞生长、葡萄糖消耗和乙醇生产，因此对两株突变菌株3.5M和3.6M分别在pH3.8和pH6.2的酸性和中性条件下进行了研究。在pH3.8条件下，突变株3.5M和3.6M比野生型ZM4的细胞生长好，乙醇生产速度快。3.5M和3.6M的生长速率分别为0.23/h和0.35/h，ZM4的生长速率为0.14/h（表1）。与菌体生长和葡萄糖消耗相一致，ZM4的发酵时间从22h缩短到了3.5M的18h和3.6M的13h，乙醇产量分别提高了21.21%和64.65%。
在pH6.2条件下，3.6M的菌体生长、葡萄糖消耗和乙醇产量与ZM4相似，优于3.5M（表1，图4c和d），说明3.5M和3.6M在酸性pH条件下葡萄糖消耗和乙醇产生能力较强，而3.6M在中性条件下与ZM4相似。
表1.野生型ZM4和突变株3.5M和3.6M在pH3.8和6.2时在RMG5中的发酵性能、消耗葡萄糖的时间(时间)、生长率、乙醇效价、产量和产量。
图4.在pH3.8(a，b)和pH6.2(c，d)条件下,野生型与突变体的细胞生长、葡萄糖消耗和乙醇产量情况。
3 基于NGS的基因组重测序和RNA-Seq研究耐酸性的潜在机制
为了阐明突变株和野生型菌株耐酸性提高的遗传基础，收集在pH3.8和pH6.2条件下培养的突变株和野生型菌株的样本，以亲本菌株ZM4(ATCC 31821)的基因组为参考，测定了突变株和野生型菌株在3.5M和3.6M上的遗传变化。通过RNA-seq研究这些菌株在酸性和中性pH条件下的整体转录差异。
WGR结果发现在突变体中发现了几个SNP，其中3.5M有7个SNP，3.6M有5个SNP（表2）。在这些突变中，4个基因的编码序列(CDS)区域都发现了4个SNP，这些突变可能有助于突变菌株对酸性pH耐受性的提高，而这些菌株的特异的突变导致这些菌株独特的表型差异。
分析不同pH条件下野生菌株与突变菌株的差异表达基因（DEG），共鉴定到781个DEG。pH3.8与pH6.2相比，3.5M中有271个DEG、3.6M有362个DEG、野生型ZM4有498个DEG。在pH 3.8下，与ZM4相比，3.5M中有246个DEG，3.6M有199个DEG，3.5M与3.6M比有144个DEG。
表2.突变株3.5M和3.6M的单核苷酸多态性(SNPs)与野生型ZM4的比较。
4 突变体中突变的基因与酸性pH耐受性增强的关系
ZMO0421的A67T突变位于催化转氨基反应的氨基转移结构域(PF00155，32-357aa)，这可能会影响酶的活性。本研究中野生型ZM4和突变菌株在pH3.8比pH6.2中PPK的表达更高。PPK的G539D突变位于C2域该结构域在PPK家族中高度保守，对酶活性至关重要，该酶的突变可能有助于提高PPK的活性，响应有毒的酸性条件。
在两个突变体中都观察到了编码RND外排系统的内膜蛋白成分的基因ZMO1432的突变，该外排系统包含12个跨膜结构域。根据TMHMM Serverv2.0的预测，突变蛋白中TM11结构域的跨膜概率从0.7提高到0.95，因此，ZMO1432的P480L突变可能增加了TM11的稳定性和刚性，从而间接提高了TM11的抗酸应激效率。
RNA-Seq结果表明，在pH3.8下，两株突变株编码由ZMO1432、ZMO1431、ZMO1430和ZMO1429组成的RND外排系统的整个操纵子的表达量均显著高于ZM4，其中3.6M的表达量最高。突变体3.6M的基因间隔区突变可能有助于下游基因的表达升高，因为3.6M在pH6.2下，这些基因的表达也比ZM4高。结合重测序和转录组结果说明RND外排泵在突变菌株的酸性抗性中发挥关键作用。
两个突变株共有的最后一个共同突变位于OxyR基因(ZMO1733)内。OxyR的T7K突变位于LysR型螺旋-转角螺旋(HTH)DNA结合域(PS50931，6-63aa)的N端，这可能是由于氨基酸从短侧链的苏氨酸转变为长侧链的赖氨酸而改变了HTH与其靶DNA序列的亲和力（表2）。转录组数据发现与活性氧(ROS)解毒相关的几个基因，如ZMO0918和ZMO1060在所有菌株中都有显著上调，尤其是在pH 3.8的ZM4中，ZMO1211在pH 3.8时仅在野生型ZM4中显著上调。由于酸性可诱导二次氧化应激，且耐酸性反应与氧化应激反应重叠，因此突变株的耐酸性可能与之相关。
由于具有这些突变的突变菌株在酸性-pH条件下与野生型ZM4相比显示出优势，因此这些突变可能是Z.mobilis抵抗酸性胁迫的关键，尽管还需要进一步的研究来帮助确认它们是否以及如何对酸性抗性表型是必要的。
5 提高酸性耐受性中膜成分相关基因的上调
内膜磷脂的修饰是降低质子通透性的一种策略，因为在酸性条件下，细胞膜的脂质成分会发生重组，这将直接或间接地影响质子的通透性。在酸性条件下，编码CFA基因的ZMO1033在ZM4中的表达上调，说明CFA基因可能与外膜修饰和耐酸性pH有关（图5b）。
6 通过增加糖酵解产生能量，降低细胞对酸性pH的抵抗力降耗
转录组测序数据表明，与pH 6.2相比，ZMO1478(pgl)、ZMO1240(gpmA)、ZMO1596(adhB)和ZMO1236(adha)四个参与糖酵解途径的基因在pH 3.8时显著上调。另外3个参与糖酵解途径的基因ZMO0997(eda)、ZMO0177(gap)和ZMO0152(pyk)在pH3.8时显著上调，而pH 6.2仅在3.6M时上调。由于这些基因参与能量的产生和再循环，因此这些基因的上调有助于产生更多的ATP，以适应酸性pH的耐受（图5c）。3个菌株在pH3.8时的最终log2OD600为1.9低于pH6.2的 2.34（图4a和c），表明在耐酸性pH上消耗更多的能量，而不是在细胞生长。
编码SsdA的ZMO1754在两种突变体中表达量均显著上调，尤其是在pH3.8时的野生型ZM4中上调更明显，而在pH3.8时的ZM4表达量显著下调（图5c）。突变株和野生型菌株中Ssda基因的表达也与乙酸产量相关。这些结果表明，在酸性pH条件下比在中性pH条件下产生更多的乙酸酯，而在酸性pH条件下耐酸性突变株比野生型ZM4产生更少的质子化乙酸酯。与野生型ZM4相比，耐酸性突变体具有较少的酸化细胞质环境，并能将用于生产乙酸的NAD+转移到糖酵解中，从而维持较低的NADH/NAD+比值。
在ZM4和突变菌株中，一些编码鞭毛结构蛋白和趋化相关蛋白的基因在酸性pH条件下比中性pH条件下显著下调（图5d），这也有助于保存细胞运动的能量，以便在酸性pH和乙醇等胁迫条件下生存。
7 转运蛋白和外排泵上调有助于在酸性条件下维持pH动态平衡
在酸性条件下，诸如乙酸盐等酸性最终产物的增加导致细胞内酸性条件加强。因此，细胞输出酸性产物对维持细胞内pH动态平衡非常重要。本研究发现两株突变体与ZM4相比，ZMO0143、ZMO1017、ZMO0799-ZMO0801等5个ABC转运蛋白基因在pH3.8时均有显著上调，ZMO1429-ZMO1432编码的RND外排泵在酸性pH条件下也显著上调（图5e）。ABC转运蛋白和外排泵基因的上调表明突变菌株在酸性条件下维持细胞质pH动态平衡的能力增强。突变株3.6M的7个编码F1F0ATP合成酶的基因和另一个编码F1F0ATP合成酶组装蛋白的基因在pH3.8相比于pH6.2显著上调（图5f）。
与呼吸链相关的两个基因ZMO0012和ZMO0568显著下调；另外六个基因ZMO0956-ZMO0958、ZMO0961、ZMO1253和ZMO1255在pH3.8的ZM4中与pH6.2相比降低了1.5倍以上。在ZM4中，6个编码RNF复合体和一个组装基因在pH 3.8时也比pH 6.2时下调，但在突变株中没有下调。ZMO0456 ZM4在酸性pH 3.8条件比中性条件表达下调。野生型ZM4在酸性条件下电子转运链相关基因表达下调，导致质膜质子分泌困难，导致生长受抑。相反，与pH 6.2相比，这些基因在酸性pH 3.8的突变体中的表达没有明显下调。相反，与pH3.8时的ZM4相比表达上调。这些结果表明，突变株在酸性-pH条件下仍能保持较高的质子转运能力。
8 提高耐酸性pH的质子消耗和碱性化合物生产
支链氨基酸(BCAA)的生物合成可以通过消耗质子或产生氨来降低细胞质中的H+浓度。在pH3.8条件下，与ZM4相比，ZMO0687和ZMO0115两个参与异亮氨酸转化的基因在两个突变株中显著上调（图5g）。与ZM4相比3.6M菌株中，编码腺苷脱氨酶(Ada)的基因ZMO0296，编码氰基底物转氨酶(Nit，EC 3.5.5.1)的ZMO1207在pH3.8时均显著上调。说明3.6M比3.5M和ZM4的中和胞内pH的能力更强，即通过质子消耗和产碱反应，提高了对酸性pH的抵抗力。
ZMO0346编码的铵转运蛋白在两个突变株中的转录水平都显著高于ZM4（图4），这可能有助于将NH3和NH4+输送到细胞外，并确保膜上PMF的正常功能。与pH 6.2相比，编码碳酸酐酶的ZMO1133在所有菌株中的转录水平在pH 3.8均显著上调。
9 降低高分子修复能耗，提高突变菌株的酸性pH耐受性
当细菌在酸性环境中培养时，细胞膜、蛋白质和DNA都会受到损伤。转录组数据发现ZM4在酸性pH 3.8时ZMO0660(dnaK)及其辅助伴侣ZMO1690(dnaJ)、ZMO1588(uvrA)及其亚基ZMO0362(uvrB)的转录水平比pH 6.2时高（图5h）。为了保护DNA和蛋白质在酸性细胞质中不受损伤，有必要增强这些蛋白的表达。
但与ZM4相比，在pH3.8条件下，突变体中除recA基因在不同pH条件下均无显著变化外，其余基因的表达水平均较ZM4下调。与ZM4相比，在pH3.8的突变菌株中ZMO1929的转录水平下调（图5h）。HtrA是一种参与异常蛋白降解的表面蛋白酶，HtrA的缺失降低了突变菌株耐受酸性条件的能力，表明这种蛋白对细胞防御酸性条件是重要的。野生型ZM4只有在酸性pH条件下才上调耐酸性必需的大分子修复基因的表达，说明ZM4在酸性pH条件下生存需要大量的这些蛋白，而这些基因在突变体中下调，表明耐酸性pH的突变体可能获得了在不触发突然增强的大分子修复活动的情况下管理防御反应的能力，从而为细胞的生长节省了能量。
10 ZM4耐酸性相关基因的遗传验证
为了确认通过上述基因组和转录学研究确定的与酸性抗性相关的候选基因的影响，以pEZ15Asp为载体，ptet为启动子，构建了6个含有候选操纵子的质粒。以空载体pEZ15Asp为对照，将这些质粒分别导入ZM4。然后在不同的条件下对这些重组菌株进行研究，以分析它们对细胞生长的影响（图6）。
随着四环素诱导剂浓度从0增加到0.8μg/mL，含有pEZ-Tc3的重组菌在pH3.8时生长优势下降（图6A和B）。在含有pez-Tc3的重组菌中，操纵子ZMO0956-ZMO0958编码的细胞色素bc1复合体可能在低表达水平上与耐酸性有关，这与本研究的RNA-Seq结果一致，即电子转移链相关基因的表达降低影响了野生型ZM4的耐酸性（图5F）。细胞色素bc1复合体的上调表达影响了中性pH条件下的生长（图6b），表明这一呼吸分支的低表达在细胞生长中的潜在作用。随着四环素诱导剂浓度从0μg/mL增加到0.8μg/mL，在酸性pH条件下，含有PEZ-T c5(M)的重组菌株的生长优势降低，而0.8μg /mL的四环素诱导剂仍具有优势，该结果与转录组结果一致（图5E）。虽然这些基因的不同表达水平与耐酸性的关系还有待进一步研究，但本研究结果表明，突变体3.6M中ZMO1432上游基因间隔区的突变可能有助于下游基因的上调，RND外排泵的高表达更有利于菌株抵御酸性pH条件。
含有其他四个操纵子的重组菌株在酸性pH条件下，无论有没有四环素诱导，都不利于细胞生长。而含有PEZ-Tc2的重组菌株在0.8μg/mL四环素诱导下生长明显受阻。无论是否添加四环素诱导剂pEZ-Tc6重组菌的生长均受到抑制。由于这些操纵子编码ABC转运子、多个药物外排和ATP合成酶提呈，这些操纵子可能与其他细胞成分协同发挥作用，因此可能需要这些操纵子与其他基因之间的微妙平衡才能抵抗酸性pH，类似于以前的研究结果，多个基因的定制同时表达对于增强大肠杆菌的低pH耐受性是必不可少的。
综上所述，虽然本研究结果表明，突变体3.6M中ZMO1432上游基因间隔区的突变可能有助于下游基因的上调(表2)，RND外排泵或细胞色素BC1复合体的高表达有利于该菌株抵御酸性pH条件(图6)，但这些重组菌株的优势仍然不如突变体本身显著。这表明一个基因/操纵子不足以保证菌株对酸性pH的耐受性，需要进一步研究影响蛋白质结构变化和多个基因表达的多个突变的协同效应，以了解耐酸性pH表型与突变菌株遗传差异的关系。
图6.含有对照质粒pEZ15A和重组质粒pET-TC3和pET-TC5(M)的重组菌和野生型，在不含四环素(a，c)和0.8μg/mL四环素诱导(b，d)的pH3.6、4.0和6.0条件下生长。
结论
本研究以野生型ZM4为出发菌株，采用ALE策略获得了两个耐酸性pH突变体3.6M和3.5M，这两个突变体在酸性条件下具有较高的生长速率和产乙醇能力。基于NGS的基因组重测序和RNA-Seq研究了酸性和中性条件下的遗传变化和基因表达，并提出了酸性抗性的潜在机制。Z.mobilis通过影响与膜修饰、质子运输、能量守恒和耐酸性重新分配相关的基因和基因表达的基因组变化来改变其代谢通量。突变菌株具有在酸性条件下差异表达的基因，以帮助加强膜相关转运蛋白，增加质子消耗和碱性代谢产物的产生，以维持质子通透性和细胞pH动态平衡。
突变体3.6M也上调了增强的F1F0ATPase，这可能是其在酸性条件下优于另一突变体3.5M和野生型ZM4的原因之一。遗传学研究结果表明，含有表达细胞色素bc1复合体操纵子的质粒构建物或RND外排泵的引入影响了Z.mobilis对酸性的耐受性。本研究获得并鉴定了耐酸性突变株，该突变株可作为酸性发酵条件下工业化生产生物乙醇的候选菌株。此外，本研究提出的Z.mobilis耐酸性的分子机制也有助于进一步研究合理设计具有更强耐酸性的合成微生物，本研究结合ALE、基因组重测序、RNA-Seq和经典遗传研究的突变进化和表征策略也可应用于其他工业微生物。
1 科研│AQUACULTURE：大黄素对嗜水气单胞菌抗菌活性的比较转录组学和蛋白质组学分析（国人佳作）
不来关注一波嘛
END