科研| Luis F. Parada等：胶质母细胞瘤细胞系分层的研究
编译：不二，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：Cell Lineage-Based Stratification for Glioblastoma
译名：胶质母细胞瘤细胞系分层的研究
期刊：Cancer Cell
IF：26.602
发表时间：2020.07
通讯作者：Luis F. Parada
通讯作者单位：美国纪念斯隆凯特琳癌症中心
DOI号：10.1016/j.ccell.2020.06.003
实验设计
结果
研究人员已发现，成人室下区（SVZ）的神经干细胞（NSC）与少突胶质细胞谱系（OLC）中胶质母细胞瘤（GBM）相关的肿瘤抑制因子突变分别导致1型和2型GBM两种不同的肿瘤类型（图1A、1B）。对7例1型和7例2型基因工程小鼠模型（GEMM）肿瘤进行转录分析，发现394个差异表达基因（DEG），其中1型GBM 189个，2型GBM 205个。基因本体论（GO）分析将1型肿瘤与NSC谱系相关的星形胶质细胞发育基因相关，而2型肿瘤DEG反映了少突胶质细胞谱系的生物学过程的丰富性，如髓鞘形成和少突胶质细胞分化。两个明显的基因家族成员ErbB生长因子受体和SoxE转录因子家族的表达存在差异，其中表皮生长因子受体（Egfr）和Sox9都在1型GBM中显著表达，而ErbB受体酪氨酸激酶3（Erbb3）和Sox10在2型GBM中显著表达（图1C-1E）。其他的ErbB家族成员Erbb2和Erbb4在这两种肿瘤亚型中都有类似的表达，同样，经典干细胞标记物SOX2也在所有肿瘤中都表达（图1D）。表皮生长因子受体（EGFR）可以通过SOX9促进GBM。在中枢神经系统发育过程中，EGFR主要表达于分化活跃的神经干细胞和传递增殖细胞，而其相关基因ERBBB3在少突胶质细胞系的发育中起着关键作用。同样，SOX9与NSC的诱导和维持有关，而SOX10是少树突细胞谱系中的主要调节因子。研究人员利用GEMM原发肿瘤组织（图1D、1E）通过qPCR、WB和免疫组织化学（IHC）分析验证差异基因表达。因此，小鼠1型和2型GBM表现出一致的表型和分子差异，并保留其不同谱系起源的转录特征。
为了检查1型和2型GBM的分子和组织病理学稳定性，研究人员在含有生长因子的标准无血清培养基中培养。1型和2型GBM培养物通过连续传代分别显示EGFR/SOX9或ERBB3/SOX10的持续高表达（图2A）。在免疫功能低下的小鼠颅内移植后，分子特征也得到了类似的保留（图2B和2C），并且WB分析显示移植瘤中激活了EGFR或ERBB3信号（图2C）。生长因子反应研究表明，1型GBM细胞在EGF存在下生长加快，而2型细胞在ERBB3受体配体、神经调节蛋白1（NRG1）的存在下生长最好（图2D和2E）。与此一致的是，2型细胞中ERBB3基因敲除阻碍了神经调节蛋白介导的细胞生长和肿瘤的发展。总的来说，这些数据证实了GEMM的1型和2型GBM肿瘤和原代细胞不同且稳定的基因表达谱、功能性细胞生长和肿瘤特性。
图2. 1型和2型GBM细胞在原代培养和颅内移植后表现出保守的分子和组织学表型
1型和2型GBM转录组和甲基化谱
研究人员通过癌症基因组图谱（TCGA）检测1型和2型GBM基因表达特征是否在人类GBM中表达，其中包括498个GBM患者样本，根据注释排除已知IDH1突变的肿瘤。Z-score转化的mRNA表达直接从cBio-Portal下载(www.cbioportal.org)。严格的标准步骤用于鉴定人类GBM转录谱。首先，在498个人GBM样本中分别检测4种小鼠1型和2型GBM标记物EGFR、SOX9和ERBB3、SOX10的表达（图3A）。共有107名人类I型候选样本被定义为EGFR、SOX9高（Z-score>0.5）和ERBB3、SOX10低（Z-score<0.5）（图3A）。相反，68名人类II型候选样本被定义为ERBB3、SOX10高（Z-score>0.5）和EGFR、SOX9低（Z-score<0.5）（图3A）。研究人员还对比了RNA测序（RNA-seq）数据（TCGA数据库中142个IDH1野生型GBM），发现样本之间的基因表达分布与芯片数据相似。在共享样本的芯片和RNA-seq之间，I型和II型候选基因有显著重叠。因此，Z-score标准化似乎并不特别偏向于芯片数据，并且独立于平台，所有四个基因的相关表达更可能反映出生物学上的区别。
接下来，研究人员使用先前从小鼠1型（189个基因）或2型GBM（205个基因）中鉴定的DEG的人类同源基因，并应用基因集变异分析，分别获得人类I型（T1DEGscore）和II型（T2DEGscore）候选者之间的相关性富集分数。107例人类I型候选样本中有52例为TCGA“核心I型”（T1DEGscore>0.1），68例人类II型候选样本中有38例被评为TCGA“核心II型”（T2DEGscore>0.1）。使用GEMM 1型和2 GBM特征对GEMM肿瘤和TCGA核心I型和II型GBM样本进行无监督的分层聚类，通过小鼠1型GBM与人类I型GBM以及小鼠2型与人类II型GBM的树状图共聚类，说明了肿瘤类型之间的相似性（图3B）。
核心Ⅰ型和Ⅱ型GBM甲基化状态的检测也显示了亚型分离。HM450数据库涵盖超过450000个甲基化位点，可用于从TCGA数据库中获得的7个I型和9个II型人类GBM核心样本。使用1000个变量最大的基因的多维标准图将I型和II型GBM核心样品分为两个不同的亚组（图3C）。类似地，HM27平台可查询27000多个CpG二核苷酸，利用探针分离出20个I型和18个II型GBM核心样本。因此，人类I型和II型TCGA-GBM核心样本可以各自通过甲基化谱聚集。
通过将52个核心I型GBM样本与其余TCGA病例（n=446）进行比较，研究人员建立了72个高表达基因的列表，作为I型基因标记物（TIsig）（图3D）。同样，对38个核心II型GBM样本与其余病例（n=460）的分析提供了80个II型基因标记物（TIIsig）（图3D）。使用TIsig和TIIsig对非核心GBM进行重新评估，确定另外87个样本为I型，54个样本为II型（图3D）。因此，通过这些标准，139个GBM分类为I型和92个分类为II型，包括46.4%的TCGA样本。
为了进一步检验这种分型方法的一致性，研究人员使用TIsig和TIIsig对146个GBM Rembrandt数据集进行了独立注释，并在与TCGA样本相同的标准下鉴定了28个I型GBM和26个II型GBM样本，并且这些样本分别与TCGA I型和II GBM的表达模式一致（图3D）。TCGA I型和II型患者的无进展生存率在考虑亚型、年龄和年龄与亚型之间的相互作用作为变量的多变量生存分析中有统计学差异（图3E），尽管总体生存率没有显著差异。
I型和II型分类是根据肿瘤组织样本的基因表达差异得出的。最近一项关于人类原发性GBM的大型单细胞测序研究为探测I型和II型特征提供了额外的肿瘤数据。研究人员首先通过平均每个肿瘤（20个GBM样本）中所有细胞的基因表达来生成表达谱，以确定每个肿瘤的I型、II型或非I/II型状态。接下来，研究人员使用基于秩的单细胞基因集富集算法（AUCell）分析了TIsig和TIIsig中的全部4916个细胞。给每个单细胞一个TIsig或TIIsig富集分数（TISIGSORE，x轴；TIIsigScore，y轴），尽管这些分数不一定具有与肿瘤组织水平上相同的生物学意义。数据表明，20个肿瘤中每一个的细胞要么主要是高TIsig评分，要么是两个评分都很低（非I型和非II型），只有少数细胞两者得分都很高。在每个肿瘤中代表的单细胞亚型与相应的GBM的亚型一致。在一个特定肿瘤内的绝大多数细胞中都可以观察到这一点。这些数据显示了单个细胞和整个肿瘤水平上的一致分层特征。
图3. 人类GBM病例的Ⅰ、Ⅱ型分类
全面的小鼠脑单细胞RNA测序研究进一步表明，细胞谱系相关的人类I型和II型GBM（例如它们的小鼠对应基因）也富含NSC和OLC谱系的基因标记（图4A）。同样，对人类I型和II型特征的TOPCLUSTER和GO分析表明，TIsig在生物过程中富集，如星形胶质细胞分化和细胞迁移，而TIIsig则富集在髓鞘形成、胶质生成和少突胶质细胞分化（图4B）。总之，这些数据一致地描绘了两种人类GBM亚型（I型和II型），它们与最初由肿瘤起源细胞系定义的小鼠亚型（1型和2型）极为相似。
所有I型GBM均显示高EGFR表达，与EGFR位点的优势扩增相一致（7p11.2；75.7%），这一特征部分符合基于生物信息学的经典（CL）分层。同样，II型GBM显示PDGFRA和KIT位点附近的基因扩增增加（4q12；分别为31.5%和23.6%），部分符合神经前（PN）分类（图4C）。GBM驱动基因突变在I型GBM和II型GBM之间没有显示出统计学上显著的偏差，除了I型GBM中的EGFR突变和II型GBM中TP53突变的增加（图4D）。值得注意的是，Ⅱ型肿瘤既没有ERBB3突变，也没有扩增增强（图4E）。因此，I型相关的EGFR表达增加主要是通过基因扩增介导的，而II型GBM中ERBB3表达的增加可能是转录调控的结果。
基于生物信息学的子分类的分析显示I型与CL和II型与PN的统计重叠。然而，当将I型和II型基因标记（TIsig和TIIsig）分别与CL和PN基因标记进行比较时，在这两种情况下，重叠基因的数量都少于20%。此外，I型和II型亚类包括通过计算方法确定为间充质（MES）的肿瘤。总的来说，I型和II型GBM标记显示出与CL和PN比较的部分收敛性；然而，与细胞谱系的转录关联分析分离出它们的特性。
图4. 人类Ⅰ型和Ⅱ型GBM标记基因及其突变
I型和II型原代GBM培养保持了核心分子特征
为了检测人类I型和II型肿瘤细胞的功能特性，研究人员从脑肿瘤中心患者来源的异种移植（PDX）建立了17种原代GBM培养，将研究限制在从未经治疗的患者样本中获得的肿瘤。通过WB筛选，研究人员从7个原始GBM样本及其对应的PDX衍生细胞中鉴定出高EGFR/SOX9和低ERBB3/SOX10蛋白表达；7个高ERBB3/SOX10和低EGFR/SOX9表达的样本（图5A）。14个样本包含一系列潜在的驱动基因突变，PDX原代培养进行mRNA-seq测序分析亚型。为了加强I型和II型原代培养物之间的转录分离，研究人员使用TIsig和TIIsig的DEG计算得分（TIDEGScore和TIIDEGScore）来区分核心I型和核心II型。4种原代培养物得分为I型，7种培养物得分为II型（图5B）。通过IHC对原始PDX肿瘤样本（图5C和5D）进行IHC验证，确认EGFR和SOX9在I型肿瘤中的表达，以及ERBB3和SOX10在II型肿瘤中表达。此外，具有代表性的I型特征基因SLC1A3和II型特征基因FA2H也存在差异表达（图5D）。与小鼠相似，人类I型和II型原代培养物也显示出对EGF和NRG1的不同生长反应。
图5. 患者来源的培养物和异种移植物中Ⅰ型和Ⅱ型GBM的鉴定
不同的药物反应功能上区分GBM亚型
接下来，研究人员研究了一组化疗药物和药物抑制剂在I型和II型肿瘤中的活性。其中，ERBB2抑制剂Tucatinib选择性地抑制小鼠2型和人类II型GBM细胞的体外生长（图6A和6B），并有效地消除下游RAS和磷酸肌醇-3-激酶的激活，同时对小鼠1型或人类I型GBM细胞没有影响（图6C和6D）。另一种ERBB2抑制剂CP724714也显示出类似的特异性。Dasatinib是c-ABL、c-SRC、c-KIT和PDGFRb等的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，也显示了对小鼠2型和人类II型细胞的特异性生长抑制（图6E和6F）。研究人员检测了已知的Dasatinib靶点在GBM亚型的差异敏感性中的潜在作用，并发现SRC磷酸化在所有GBM细胞中均受到同等程度的抑制（图6G、6H）。此外，2/II型细胞中的SRC磷酸化不受Tucatinib的影响，因此排除了作用。未检测到c-KIT和c-ABL蛋白酪氨酸磷酸化，这也排除了它们可能是Dasatinib的介质。在II型细胞中， PDGFRb磷酸化与ERBB2和ERBB3酪氨酸磷酸化和下游信号一起减弱。这种对PDGFRb的影响在I型细胞中没有发现。然而，Imatinib，一种有效的PDGFRb抑制剂，并没有优先抑制II型细胞的生长，排除PDGFRb。因此，在小鼠1型和人类I型GBM细胞中，Tucatinib和Dasatinib的抗性依赖于EGFR活性的保留及其维持有效下游信号的能力。在敏感的II型和2型细胞中，ERBB2/ERBB3活性是必需的，并且直接受到Dasatinib介导或通过其下游信号传导的抑制。5-Azacytidine，一种抑制DNA甲基化的核苷类似物，对II型细胞也有部分抑制作用。综上所述，这些物种保守的差异药物反应说明了谱系分层GBM亚型之间的一致和不同的功能特性。
图6. 2/II型GBM对Tucatinib和Dasatinib的差异反应
Dasatinib抑制2型和II型GBM的体内生长
为了进一步检测物种保守亚型之间的生物学差异，并考察基于谱系的GBM分层的潜在临床应用，研究人员评估了Dasatinib对小鼠1型和2型以及人类I型和II型GBM生长的影响。首先，建立小鼠1型和2型GBM细胞的皮下同种异体移植，并在移植后3天开始每日灌胃Dasatinib（50 mg/kg），持续5周（图7A）。与对照组相比，1型GBM生长在质量上略有减弱，但缺乏统计意义（图7B-7D）。相比之下，2型GBM在肿瘤体积和重量方面表现出明显且具有统计学意义的抑制作用（图7E-7G）。HE染色和Ki67 IHC显示Dasatinib治疗的1型肿瘤在组织学和增殖方面没有明显差异（图7H和7I）。相反，Dasatinib治疗2型肿瘤显示出细胞组织模式的改变，出现纤维状、束状、水肿和粘液样改变，并且通过Ki67 IHC测量有丝分裂指数降低（图7H和7I）。1型和2型GBM皮下移植物在Dasatinib治疗后保持各自的Egfr/Sox9和ErbB3/Sox10的标记基因表达。
接下来，研究人员在PDX模型上评估了Dasatinib的活性。用表达荧光素酶/GFP（Luc-ZsGreen）的慢病毒感染I型和II型PDX原代细胞，筛选GFP表达（Luc-ZsGreen+），并将其植入裸鼠脑内。每周用生物发光成像监测肿瘤生长（图7J-7O）。Dasatinib治疗开始于移植后2周，一直持续到动物出现神经症状和发病率。Dasatinib和对照治疗小鼠的I型肿瘤生长相似（图7J-7L）。磁共振成像（MRI）也得到了类似的结果，显示肿瘤大小没有明显差异。相比之下，II型GBM对Dasatinib表现出显著的反应，表现为荧光变暗（图7M-7O），MRI测量肿瘤大小减小，中位生存期延长（从76天到98天，p=0.0041；图7P）。肿瘤的HE分析显示，组织学特征改变，包括纤维和束状结构，如Dasatinib治疗的皮下2型GBM（图7Q）所示，通过Ki67分析（图7R）测得的有丝分裂指数降低（图7R）。总之，体内数据显示小鼠2型和人类II型GBM对Dasatinib具有独特、可测量和可重复的良好反应。用质谱法测定人颅内II型和皮下小鼠2型GBM组织中的肿瘤内Dasatinib水平。皮下给药比颅内给药更有效，这可能是前者更明显的抑制作用的原因。
尽管有明显的延迟，所有Dasatinib治疗的II型小鼠最终都发展成肿瘤（图7P）。因此，研究人员通过在研究终点对颅内肿瘤组织进行WB印迹分析来检测信号传导的状态。Dasatinib和载体治疗的II型新鲜肿瘤组织均显示出类似的Ras下游信号，表明前者的药物通路抑制被回避。接下来，研究人员从收获的Dasatinib治疗的II型肿瘤中制备原代培养物，并检测其对药物的反应。Dasatinib治疗的颅内II型肿瘤的原代细胞培养显示出对Dasatinib和Tucatinib的生长敏感性。此外，两种肿瘤源性细胞对NRG1或EGF刺激表现出持续的反应。因此，尽管Dasatinib在体内的治疗时间延长，肿瘤生长明显延迟，但移植的II型GBM细胞显然没有获得耐药性。体内耐药的原因尚不清楚，但可能与微环境影响或肿瘤细胞可塑性有关，后者不包括II型标志物的丢失，因为在这两种情况下它都保持稳定。
图7. Dasatinib抑制2型和Ⅱ型GBM的体内生长
结论与讨论
利用现代基因组工具对相关的肿瘤进行分子亚分类，可以为鉴别和评价表型和预后提供有力的手段。本研究将特定的转录谱和特征标记分配给两类GBM，这两类GBM是在相同的GBM相关驱动基因突变下不同谱系细胞中诱导的。不同的表型由肿瘤谱系特征出现和分离（SVZ衍生的1型与OLC衍生的2型）。在原位移植后，转录特征在增殖细胞培养中保持稳定，并可在人类GBM数据库（TCGA）中识别。人类I型和II型GBM培养物和原位肿瘤，也保持稳定的分子和功能特性。值得强调的是，在数据集和PDX中确定的I型和II型肿瘤亚型具有代表性的胶质瘤相关驱动基因突变，而不是最初产生1型和2型GEMM的基因。通过原代培养和体内对生长因子和化疗药物的物种保守性差异反应，可以验证基于谱系的GBM分层功能。
除了说明两种GBM亚型之间的生物学差异外，这种分层的药物敏感性差异还具有潜在的应用价值。Dasatinib此前在复发性GBM的2期临床试验中未通过疗效试验。在随机试验中，分子分类的II型GBM患者的潜在临床反应是否会被大多数非II型病例的过度代表所掩盖，尚待确定。Dasatinib是一种广谱酪氨酸激酶抑制剂。研究人员的结果提示Dasatinib也可能直接抑制ERBB3介导II型肿瘤抑制。文献报道的Dasatinib解离常数测定表明ERBB3结合亲和力可能足以介导功能性抑制。与ERBB2特异性抑制剂Tucatinib的功能活性和信号通路的相似性进一步支持了这种可能性。对这两种化合物的进一步研究将有助于解决这个问题。
本研究仅限于治疗患者的肿瘤样本，未评估放疗后和temozolomide治疗后的疗效。在这一分层下对抗癌化合物的额外研究和调查可能会进一步揭示亚型特异性反应。研究人员意外地发现，从Dasatinib治疗的PDX小鼠的残余肿瘤中提取的原代培养物恢复了完全的药物敏感性，同时RAS和AKT信号通路受到抑制。考虑到体内治疗极大地延迟了肿瘤生长，并减弱了下游信号，这些结果表明，随着时间的推移，肿瘤微环境可能会引起Dasatinib的不敏感性。肿瘤细胞的可塑性也可能在体内和培养条件之间波动，而不是2/II型特征的丢失。
基于TCGA的基因组GBM数据集的计算分层在该领域发挥了主导作用。虽然有价值以及广泛应用，但这种方法缺乏生物学基础。人类肿瘤在突变谱、起始年龄、易感因子和/或体细胞突变方面的异质性都可能有助于计算基因组亚群的识别。相比之下，具有明确的起始突变、起源细胞和起始时间的小鼠模型可能会引起对物种间保守的基本生物学过程的关注，因此，更有可能揭示功能决定因素。然而，患者分层评估临床试验结果仍然是一个至关重要的目标。在一项回顾性研究中，Bevacizumab对新诊断的神经前GBM有临床益处，但仍有待验证。
研究人员为大约一半的GBM分层提供了一个有说服力的生物学前提，这些GBM与基于生物信息学的转录PN和CL亚类表现出部分收敛特征，尽管存在显著差异。一系列可能性有助于解决剩余的非I型和非II型GBM的分层问题。例如，成年啮齿类动物的大脑在海马体、下丘脑和脑桥中有更多不同的干/祖细胞群。研究人员的初步数据表明，这些群体也能在基因工程小鼠体内产生GBM，从而潜在地扩大了来源肿瘤细胞和相关分子亚型的可能。需要继续进一步研究才能得出答案。
最近的报告引发了关于成人大脑中存在干细胞的争论。研究表明，在啮齿类动物中，不仅干/祖细胞是GBM的主要来源，而且实际上分化程度更高的细胞类型缺乏产生GBM的潜力。鉴于鸟类、啮齿动物和灵长类动物中存在功能成熟的中枢神经系统干细胞群，以及人类中的研究报告，很难想象将这种可塑性排除在中枢神经系统（CNS）中会产生怎样的进化优势。因此，研究人员的研究表明干细胞在人类中枢神经系统中的持久性以及在GBM的发展、特性和表型中的基本作用的研究是一致的。
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