重磅科研 | Cell：借助单细胞测序揭示限制热量调控衰老过程的奥秘（国人高分作品）
编译：寒江雪，编辑：十九、江舜尧。
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衰老会导致全身组织功能下降，由于限制热量（CR）可能会延缓该过程。然而细胞形态和衰老特征，以及CR改善的细胞形态和特征目前仍不清楚。本研究中建立了全面的涵盖了经历衰老和CR的各种大鼠组织的单细胞和单核转录图谱。CR减弱了与衰老相关的细胞类型组成、基因表达和核心转录调控网络的变化。在衰老过程中免疫细胞增多，而CR有利于逆转衰老干扰的免疫生态系统。计算预测显示，在衰老过程中观察到的异常细胞-细胞交流方式，包括过度的促炎性配体-受体相互作用被CR逆转。本研究提供了与哺乳动物衰老和CR相关的多组织单细胞转录图谱，加深了对CR对衰老的干预的理解，并揭示了代谢干预如何作用于免疫系统来改变衰老过程。
论文ID
原名：Caloric Restriction Reprograms the Single-Cell Transcriptional Landscape of Rattus Norvegicus Aging
译名：限制热量调控老鼠衰老进程的单细胞转录组分析
期刊：Cell
IF：36.216
发表时间：2020.3
通讯作者：刘光慧
通讯作者单位：中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室
DOI号：10.1016/j.cell.2020.02.008
实验设计
试验材料：18月龄的大鼠随机分为两组，分别进行正常喂养和70% 的CR喂养。5月龄正常喂养的大鼠为Y-AL组，27月龄正常喂养的大鼠为O-AL组，27月龄CR喂养的大鼠为O-CR组。随机选择三组中的个体取棕色脂肪、白色脂肪、肝脏、肾脏、主动脉、皮肤和骨髓。
试验方法：通过H&E染色，马森染色，SA-β-Gal染色，TUNEL染色和油红O染色等试验观察细胞变化；通过ELISA，WB，流式细胞分析，基因敲除等分子实验分析样本蛋白水平及表型分析。通过snRNA-seq和scRNA-seq测序（测序平台：10×Genomics），聚类并识别细胞类型，分析细胞类型组成变异，分析差异表达和差异细胞网络并进行GO注释，构建转录因子-靶基因网络，分析细胞间交流模式。
结果
1 CR对寿命和衰老特征的影响
18月龄的大鼠被随机分配到AL或70%的CR饮食中（图1A），经过9个月的饮食干预，AL组和CR组大鼠均为27个月龄，分别为O-AL组和O-CR组。O-AL组和O-CR组的大鼠与AL的5个月龄大鼠(Y-AL组)进行对比分析。9个月后，与O-AL对照组相比O-CR组大鼠体重降低了1/3，血糖没有明显变化（图1b），CR延长了O-CR组大鼠的寿命中位数和最长寿命（图1b），同时还对衰老相关组织的形态学变化产生影响。适度的CR延迟了与衰老相关的表型的开始，并延长了大鼠的寿命。
2 利用scRNA-Seq技术构建大鼠单细胞图谱
为了了解衰老和CR对不同组织的细胞类型组成和转录图谱的影响，研究人员绘制了Y-AL、O-AL和O-CR的单细胞图谱。分离Y-AL、O-AL和O-CR大鼠的BAT、WAT、肝脏、肾脏、主动脉、皮肤和骨髓(BM)，共获得166,111个合格细胞用于后续分析（图1C）。共确定了109个细胞团，它们可分成七种组织中的42种主要细胞类型（图1D）。在这些细胞类型中，有20多种是组织特异性的，例如肝脏中的CYP2E1+肝细胞和脂肪组织中的PDGFRA+脂肪来源干细胞(ASC)。而PECAM1+内皮细胞(EC)和Lum+成纤维细胞存在于BAT、WAT、主动脉、皮肤和肝脏等大多数组织中（图1E）。在骨髓和其他六种组织中都发现了Ptprc+细胞，并将其细分为18种免疫细胞类型，包括中性白细胞、M1(促炎性)巨噬细胞(M1)、M2(抗炎)巨噬细胞(M2)、细胞毒性CD8+T细胞(T2)、B细胞和浆细胞（图1D和E）。研究人员生成了一个细胞多样性的多组织表达图谱，构建了一个比较框架并为进一步研究衰老和CR建立了细胞路线图。
3 CR重建衰老的细胞生态系统
为了描述衰老和CR过程中细胞类型组成的动态变化，比较了Y-AL、O-AL和O-CR组七种组织中每种细胞类型的比例。与Y-AL相比，O-AL中各种细胞类型的比例发生了变化，其中许多变化被CR挽救（图2A）。例如皮肤中的BC2(Krt14+上皮干细胞)和BAT中的ASC的比例随着年龄的增长而降低，CR后略有增加，表明CR可以阻止与年龄相关的干细胞的耗竭。CR抑制了老龄主动脉平滑肌细胞(SMC，SMA+)的减少，这与衰老相关的血管壁中层凋亡细胞增多一致，而CR则相反，说明CR可以降低老化血管的硬度。骨髓中ProB、LPB、IB、T2、DC，ProE和Ery细胞随月龄增大而减少，而CR可有效增加这些细胞。
除骨髓外的多个组织中的免疫细胞(Ptprc+细胞)的数量在衰老过程中增加，而这种增加可以被CR阻止（图2B）。中性白细胞和浆细胞数量在老化衰老过程中明显增加，在CR后明显减少（图2C和D），并通过免疫染色证实了这些变化。M1与M2巨噬细胞的比率(慢性炎症的指标)在多个老龄组织中增加，在BAT、皮肤和主动脉中被CR逆转（图2E），说明CR可以诱导巨噬细胞从促炎状态向抗炎状态转变。
4 CR逆转衰老相关基因不同组织表达变化的研究
为了揭示与衰老和CR相关的分子机制，鉴定了O-AL和Y-AL间以及O-CR和O-AL间的DEG，分别为“衰老DEG”和“CR DEG”（图3A-3G，图4A）。对这些DEG的综合比较分析进一步确定了被CR挽救的衰老DEG，称为“挽救DEG”。
为了区分衰老和CR对每个组织的影响，将衰老、CR和挽救DEG归因于每种组织类型。根据DEG的数量发现主动脉组织、BAT和WAT都是受衰老和CR影响较大的组织（图4B）。尽管细胞类型发生了变化（图2A），在衰老和CR后，BM中DEG最少。说明衰老和CR的组织特异性，多组织比较可以更好地理解衰老和CR的机制。分析了因CR进一步增加的上调衰老DEG和进一步减少的下调的衰老DEG。而这些代谢物仅占衰老代谢物的1.8%左右，表明CR只产生了较小的副作用。
对衰老，CR和挽救DEG进行GO注释，在衰老过程中不同组织普遍下调基因在血管发育、细胞对生长因子的反应、再生和细胞外基质组织等方面注释，并且它们的下调被CR所拮抗（图4C）。衰老还导致参与炎症反应、先天免疫反应和细胞死亡正向调节的多个途径同步增强，又被CR减弱。组织间衰老和挽救DEG功能分析进一步支持了CR在抗炎、组织再生和促血管生成途径中的作用，所有这些途径都有助于老龄保护。
为了确定多个组织共有的挽救DEG韦恩图分析发现至少在三个组织中的有46个下调衰老DEG被CR重新激活，而在至少三个组织中的有34个上调衰老DEG被CR抑制（图4D）。这些被CR挽救的不同组织的衰老DEG可能是CR干预的重要生物标志物和靶点。
5 CR逆转衰老相关细胞类型特异性基因表达网络的研究
研究人员探究衰老、CR和挽救DEG在这七种组织中的细胞类型特异性，发现衰老和CR的影响不仅是组织特异性的，同时还具有细胞类型特异性（图5A）。ALPC，NKT和中性白细胞是7种组织中受衰老影响较大的几种细胞类型。从DEG的数量来看，ALPC、M2和EC是CR最有效的挽救对象。就组织特异性而言，根据衰老DEG数量发现中性白细胞、M1和M2是WAT中受衰老影响较大的三种细胞类型；在这些细胞类型中，CR更有效的挽救了M2和EC。在BAT中，NKT、M2和EC是衰老DEG中数目前三多的细胞类型，而且都有效的被CR挽救。在主动脉组织中，ALPC、SMC和成纤维细胞是衰老DEG中数量前三多的细胞类型，通过CR，ALPC最有效地恢复到更年轻的状态（图5A和B）。
不同细胞类型的上调挽救DEG在与发育、再生、对生长因子的反应、细胞外基质组织和对皮质类固醇的反应相关的GO方面都是富集的。不同类型的细胞中下调挽救DEG在炎症、天然免疫反应、对脂多糖的反应、对白细胞介素的反应、活性氧(ROS)代谢过程和凋亡信号通路相关方面富集。该结果分析得出了不同组织中受年龄和CR影响的关键细胞类型。
在衰老过程中，S100Aa9、S100a8和lgkc在40多种细胞类型中上调，在30多种细胞类型中又被CR下调。Ybx1在30多种细胞类型中下调，并在20多种细胞类型(包括WAT中的ASC)中被CR上调。为了研究Ybx1在调节细胞内稳态中的作用，研究人员在大鼠和人的WAT和ASC中敲除了Ybx1使细胞增殖能力丧失，这与干细胞在体内的耗竭是一致的，并用敲除Ybx1的ASC样本进行转录组分析。GO分析显示下调基因主要在与细胞分裂和DNA复制有关，这与观察到的Ybx1基因敲除后细胞增殖能力的丧失是一致的。上调基因与趋化性和细胞因子的分泌有关（图5G），由于Ybx1缺失导致SASP因子(包括ll1b)表达上调一致。说明在ASC中，Ybx1可能在衰老和CR效应中发挥关键的分子开关作用。
研究人员接下来探索典型的衰老标志和营养感知通路是否在单细胞水平上受衰老和CR的细胞类型特异性调控。经典的促衰老基因和SASP基因(Nfkbia、ll6和ll1b)在大多数组织和细胞类型中上调，并被CR部分抑制。与CR在调节营养感知、细胞外结构和生长因子途径方面功能一致，挽救基因包括与AMPK、mTOR、胰岛素样信号(ILs)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(ppar-g)以及细胞外结构组织和细胞对生长因子刺激途径的反应有关的基因。这些结果在单细胞水平上提供了对啮齿动物衰老和CR的整体评估，并强调了大规模、平行的基因表达分析在研究复杂生物现象方面的有效性。
6基于CR的转录调控网络的重构
为了了解衰老和CR的转录调控网络，使用SCENIC预测了七种组织中调节衰老和CR DEG的核心转录因子（TF）（图6A-B）。在BAT，WAT，肾，主动脉，肝脏和皮肤组织中分布着一些在衰老过程中失调的转录因子经CR修复称为挽救TF（图6C-F）。在WAT中确认了5个挽救TF（图6E-F）。受CR挽救的TF主要是组织特异性的，Cebpd是一种参与炎症和脂肪形成的亮氨酸转录因子，在BAT、WAT和皮肤中在衰老过程中下调，并被CR上调。另一种亮氨酸转录因子Cebpb调节炎症反应、脂肪生成和组织再生相关的基因在皮肤、主动脉和肝脏中下调并被CR上调。在WAT中与衰老相关的Cebpd和Cebpb的下调炎症激活中的两个中心转录因子Nfkb1和Rel在衰老过程中被下调，同时被CR上调（图6C-E）。这些数据表明，CR对衰老受损的转录调控网络进行了重新编程，参与炎症和脂质代谢的TF可能受到衰老和CR的相互调节。
7通过计算模型预测CR消除衰老相关的异常细胞间交流方式
细胞间的交流方式的改变是衰老的一个综合标志。为了研究各种配体-受体相互作用在衰老和CR期间的重新分布，研究人员计算了Y-AL、O-AL和O-CR组织中每对细胞类型中的配体-受体对的数量以及同一细胞类型的自分泌信号中的配体-受体对的数量。在七个组织中确定了456种不同细胞类型的潜在配体-受体相互作用对。与Y-AL相比，O-AL组织的细胞间交流功能增强。在BAT、BM、肾组织和肝组织中O-AL中特定细胞类型之间的许多细胞间交流被CR所破坏（图7A）。EC广泛存在于多种组织中，与其他细胞类型的相互作用在衰老过程中普遍增加并在CR时被抑制，说明EC可能是CR介导的靶向衰老干预的一种常见细胞类型。
为了识别在衰老和CR过程中受影响的配体-受体相互作用的功能，对仅存在于O-AL而不存在于Y-AL或O-CR的细胞间相互作用进行了GO和通路富集分析。大多数被消除的相互作用发生在细胞因子和细胞因子受体之间（图7B）。例如，TNFSF13B和TNFSF13是两个高度同源的细胞因子，属于TNF配体超家族，是浆细胞的关键生存因子。它们与受体TNFRSF13B的相互作用随着年龄的增长而增加，而在WAT、肾组织和主动脉组织中，它们与受体TNFRSF13B的相互作用被CR消除，同时这些组织中的浆细胞频率也发生了变化（图7C）。CR缓解了衰老过程中异常的细胞-细胞交流模式尤其是介导炎症反应的交流模式。
8衰老和CR过程中细胞类型组成和转录谱的性别二型变化
为了确定在单细胞转录水平上对衰老和CR的反应是否存在性别二型性，研究人员比较了雄性和雌性的数据。衰老对细胞类型组成的破坏、衰老DEG和相应的GO注释没有显著差异。发现了衰老的组织特异性转录反应中的性别二态敏感性，雄性BAT对衰老的敏感性更高，雌性主动脉对衰老的敏感性更高。衰老过程中单细胞转录区的变化可以被CR部分挽救，在雄性和雌性大鼠的炎症反应相关方面都是富集程度最高的。雄性大鼠的挽救因子与衰老因子的比值高于雌性，说明CR对雄性大鼠的衰老影响更显著。本研究展示了一个多维的啮齿动物单细胞转录图谱来研究衰老和性别特异性效应的CR的影响，从而为衰老和代谢领域提供了一个全面而有价值的资源。
9脑和骨骼肌细胞衰老和CR后的单细胞核转录图谱
脑和骨骼肌(SM)是受衰老和CR影响的两个重要组织。为了增加衰老和CR图谱的范围和复杂性，进行了单细胞核RNA测序(snRNA-seq)。在三组动物的大脑和SM中获得了25021个和28131个细胞核。确定了脑组织中的10种主要细胞类型和骨骼肌中的11种主要细胞类型。
分析了衰老和CR期间脑组织和SM中细胞类型组成的多样性。与BAT和肝组织的观察结果相似，O-CR大鼠脑组织和SM中的EC数量均减少，而脑组织中的EC数量部分恢复。在衰老过程中抑制性神经元的百分比降低，在CR后恢复，与人脑抑制性神经元与年龄相关的突触变化一致。与年轻的对应组织相比，老年骨骼肌的卫星细胞数量减少，但CR不能使其恢复。可能是由于核RNA和细胞质RNA的丰度不同所致，nRNA-seq的DEG在脑组织和骨骼肌中的数量远低于scRNA-seq在其他组织(除骨髓外)中的数量。骨骼肌中总共鉴定出30个挽救基因，大约一半是细胞骨架基因。在大脑中的12个挽救基因中，4个基因与细胞对DNA损伤的反应有关，它们在衰老过程中下调，并在CR时得到增加。这部分在大脑和SM中研究了衰老和CR转录组水平的研究，为大脑和SM的具体老化机制和干预措施提供有价值的信息。
结论
本研究对大鼠的多个组织进行整体转录组分析，以研究其单细胞水平的衰老及CR对其调节作用。分析了9种组织中超过21万个单细胞和细胞核。细胞类型组成、细胞和组织特异性分子过程、调节转录因子(TF)和细胞-细胞交流网络等方面评价衰老和CR对不同组织的系统影响。在衰老过程中观察到这些方面的紊乱，并通过CR部分挽救，其在脂肪和主动脉组织中观察到的效果最显著。CR挽救了与衰老相关的细胞类型组成的改变，这些细胞在衰老过程中增加，在多个组织中被CR减少。在转录水平上，超过1/4的青年和老年DEG编码与脂质代谢和免疫调节相关的核心调控转录因子的基因被CR逆转。通过模型预测分析发现CR会减轻细胞间与衰老相关的异常交流。本研究通过多组织单细胞转录组分析，提供了丰富的衰老和CR对衰老影响的分子信息，拓展了人们对CR干预衰老的认知，强调免疫系统和代谢干预之间的关键节点可能调节衰老的过程。
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