科研 | Cell Reports：高光胁迫下拟南芥转录组的特异性和动态反应研究（国人佳作）
编译：贤，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：The Arabidopsis Transcriptome Responds Specifically and Dynamically to High Light Stress
译名：高光胁迫下拟南芥转录组的特异性和动态反应研究
期刊：Cell Reports
IF：7.815
发表时间：2019.12
通讯作者：赵小宝、Joanne Chory
通讯作者单位：浙江大学&美国索尔克生物研究所
DOI号：10.1016/j.celrep.2019.11.051
实验设计
哥伦比亚野生型拟南芥种子培育生长一周后，一半的拟南芥在1200 µmol m-2 s-1 的高光下培育，并设置培养箱温度11.5℃以确保拟南芥叶片温度为22℃，另一半在60 µmol m-2 s-1光照培育，温度同样控制在22℃；然后分别在0.5 h，6 h，12 h，24 h，48 h和72 h的时间点采集两组样品，并且将高光 72 h后的拟南芥置于正常生长条件下恢复14 h后再次收集样品。每组每个时间点取样两个生物学重复，每个重复25株拟南芥（图1）。
结果
1. 短期、中期和长期HL胁迫的拟南芥的动态转录组分析
经过在相同时间点的配对比较下，总共在HL胁迫下至少一个时间点鉴定了5403个差异基因（DEGs）；其中，在0.5、6、12、24、48和72小时的DEGs分别有1300、1780、2021、3081、2681和2885个（图2A）。与72h HL（HL72h）相比，恢复后的样品具有2,156 DEGs，而与GL（GL72h）相比仅具有604 DEGs（图2A）。所有DEG的表达谱聚类分析表明HL胁迫可分为明显的短期（0.5 h），中期（6至12 h）和长期（超过24 h）（图2B）。顺式作用元件分析，在大多数时间点，G-box（CACGTG）在DEGs的启动子中明显富集（图2C）。从不同的HL持续时间中识别出所有DEGs的9种表达趋势簇，包括两个主要簇：逐渐下调（1,227个基因）和逐渐上调（560个基因）（图2D）。动态适应光合能力以增加光所必需的GPT2位于簇31中。MAPKKK18在HL胁迫下上调位于簇33中。在弱光向HL偏移后的10和30分钟，ERF6表现出明显的上调，随后出现强烈下降，位于簇35中。光照恢复正常水平后，约有57％的上调基因被下调，而66％的HL下调基因被上调。当使用2倍变化作为标准时，79％的HL72h DEGs将其表达恢复到非应激水平，而其余的（21％）则不能恢复。
前人研究表明，短期HL高强度诱导了许多热休克因子（HSF）和HSP基因，包括HSFA2，HSP70，HSP17.6A，HSP18.2和HSP21。但是，在本文数据中，HSP18.2在HL下未显示差异表达，而HSP70，HSP17.6A和HSP21在HL处理0.5和6小时后未诱导或诱导程度较低（图2E）。研究人员通过qPCR证实了这一观察结果（图2F-2J），发现大多数HSF和HSP基因仅由温度较高的HL诱导。这些结果表明在短时HL处理下这些HSF和HSP基因的诱导是热驱动的。
2. 核心HL应激反应基因集分析
在5403个DEGs中，在所有6个HL时间点差异表达了250个基因（图3A）。这250个基因可能是核心的HL反应基因，其表达模式分为三类。第一类中的基因表达显着下降，第二类基因的表达显示不到5倍的中等增加，第三类基因的表达显着增加（图3B）。在250个常见基因中，除了已知的HL响应基因（例如ELIP1，ELIP2，GPT2和RHL41）之外，还发现了一些高度诱导的基因（例如ELI3-2，AT1G71000和BAM5）和严重抑制的基因（例如BBX17，SAUR3和SAUR27）。此外，有5个基因来自B box（BBX）基因家族，另有9个基因来自SAUR基因家族。在所有6个时间点，5个BBX基因中的4个被下调，而BBX31被上调（图3C）。根据拟南芥的顺式组数据，BBX31是ELIP2的上游调节子（图3D），此外，HL调节了18个BBX基因（图3C）。从HL的0.5小时到72小时，所有9个SAUR基因均下调，在至少一个HL时间点共差异表达了46个SAUR基因（图3E）。
核心DEGs的共表达网络构建首先使用RHL41作为种子基因提取了子网络，该基因参与了HL应激反应。RHL41在共表达网络中有67个连接，其中ELIP1和ELIP2，BBX17，BBX27，SAUR15，SAUR27和SAUR29也与RHL41共表达。在共表达网络中具有最高程度和中间性中心性的前三个枢纽基因是AT1G27210，AT4G01330和BBX14。AT1G27210是ARM重复超家族的成员，具有129个连接（图4A），AT4G01330是一种蛋白激酶基因，具有124个连接（图4B），BBX14具有112个连接（图4C）。这三个中枢基因都与ELIP1，ELIP2和GPT2共表达，表明这些基因可能是潜在的重要的HL反应调节因子。此外，研究人员获得了AT1G27210和AT4G01330的突变体，并在HL下分析了它们的表型，发现在HL约20 h后，与野生型相比，AT1G27210突变体产生更多的白色叶片，表明该基因可能在HL应激反应中起重要作用。
3. HL应激反应下的激素生物合成和信号通路分析
为研究激素在HL应激反应的不同持续时间中的作用，分析了不同植物激素的生物合成基因的表达变化。ABA和JA生物合成途径中的大多数基因在所有时间点均显示出增加的表达。SA，乙烯和赤霉素（GA）生物合成基因仅在几个时间点显示出明显的表达变化（图5A）。从ABA生物合成基因中鉴定了9种DEGs，包括NCED3，NCED5和NCED9，它们在HL胁迫0.5 h后上调，而NCED2仅在HL胁迫24 h后表达增加。此外，ABA信号通路基因受HL调节（图5B）。 14个ABA受体基因中有6个是DEGs，其中大多数在HL后被下调。9个A PP2C基因中的8个被HL持续上调（图5B）。通过在每个时间点测量GL或HL条件下植物中的ABA水平，发现HL 0.5 h后，ABA水平略有升高，HL 6 h后，ABA水平显着增加了2倍以上，然后在整个HL期间保持较高水平。恢复期间ABA水平下降，但仍高于GL对照（图5C）。为了验证ABA在HL中的作用，我们研究了ABA生物合成缺陷型nced3nced5的植株表型。HL 24 h后，nced3nced5突变株对HL过敏。与野生型相比，更多的突变植物的叶片大面积白花（图5D）。为了量化表型，研究人员发现nced3nced5突变体与HL下的野生型相比叶绿素含量更低（图5E），这表明ABA是HL应激反应所必需的。
17个JA生物合成基因中的12个基因具有差异。9个SA生物合成基因中的7个是DEGs，12个乙烯生物合成基因中的9个在至少一个时间点差异表达。在24种GA生物合成基因中，有11种在至少一个时间点差异表达。众所周知，BR，植物生长素和细胞分裂素可调节植物发育的许多方面，并且它们的许多生物合成基因转录丰度发生变化（图5A）。在长期HL下，BR生物合成途径基因在所有时间点均表达受到抑制，而涉及植物生长素和细胞分裂素生物合成的基因则表达降低。因此，JA，GA，BR，生长素和细胞分裂素信号通路基因均受HL调节。
4. 蓝光/ UV-A受体和PIF的基因对HL应激反应研究
通过分析红光远红光受体（PHYA，PHYB，PHYC，PHYD和PHYE），蓝光/ UV-A受体（CRY1，CRY2，PHOT1，PHOT2，ZTL，FKF1和LKP2），UV-B受体（UVR8）和PIF（包括PIF1，PIF3，PIF4，PIF5和PIF7），发现GL和HL之间PHYA至PHYE的表达水平相似。但是，HL后CRY1和PHOT1被下调，而FKF1显示快速上调，然后下调（图6A）。HL下蓝光/UV-A受体基因的相似表达模式可以解释不同受体在适应HL中的协同关系。隐花色素与UVR8相互作用，是植物在自然和模拟阳光下生存所必需的。另一方面，研究发现HL胁迫后PIF1，PIF4，PIF5和PIF7基因下调了（图6B）。为研究PIF基因在HL应激反应中的作用，研究人员检查了pif1，pif4，pif5，pif7，pif4,5和四倍突变体pif1、3、4、5（pifq）的表型。HL 24小时后，pif4，pif5，pif4,5和pifq突变体表现出HL超敏表型。突变体的叶片变白植株更多，与野生型相比，突变体的叶片变白植株更多，面积更大（图6C）；与HL下的野生型相比，pif4，pif5，pif4,5和pifq突变体的叶绿素含量更低（图6D）。
5. 中长期HL下编码光合作用的基因表达分析
在HL 0.5 h后，大多数光合作用基因的表达变化不大；但在HL 6 h后被显著抑制，表明植物对光系统和反应中心进行了调整，以捕获更少的光合作用光能。在光系统I中的11个核编码基因从HL的6到72 h被下调，并且在恢复后被上调（图7A）。在光系统II中，PsbP1，PsbO1，PsbQ1和PsbQ2的表达下调（图7A）。HL后也抑制了编码LHCI蛋白（包括Lhca1，Lhca2.1，Lhca3和Lhca4）的基因的表达（图7A）。在HL下，编码LHCII蛋白的16个基因中的13个的转录水平降低（图7A）。在HL 48h，PPL1和PnsL4的表达下调了2倍以上。大多数参与Calvin-Benson循环的基因并没有改变其细胞表达。这表明HL与Calvin-Benson循环相比对光反应的危害更大，与植物生长相关激素基因和光合基因的下调一致，HL处理24小时后，与对照相比，经HL处理的植物的鲜重显着降低，这表明长期HL抑制了植物的生长（图7B）。
6. HL处理6小时后，花色苷生物合成基因
花青素可以起到防晒作用，通过吸收蓝绿色和紫外线来保护细胞免受光抑制和损害。本文分析了花色苷生物合成基因的表达谱。PAL1，C4H和4CL蛋白参与了花青素生物合成途径的起始步骤，其对应的6个基因都是DEGs。自HL 0.5小时起PAL3被下调，而HL 6 h后其余基因被上调（图7C）。查尔酮合酶，查尔酮异构酶和黄烷酮3-羟化酶（F3H）是类黄酮途径的初始步骤。HL 6 h后，编码这些酶的5个基因被上调，并在长期HL中保持高表达水平。三个MYB转录因子基因（MYB11，MYB12和MYB111）在所有6个时间点均上调（图7D）。后期步骤将二氢黄酮醇转化为花青素并修饰花青素。涉及这些步骤的18个基因被差异表达（图7E）。HL处理12 h后，花青素含量显着增加，并随HL处理时间的推移而不断累积。恢复后，花色苷含量下降，但仍高于未处理的对照（图7F）。
讨论
本研究揭示了不同时间下HL胁迫的转录变化的相对动态，并且在每个时间点，每个差异表达的基因首先显示出显著变化，以及变化的幅度和持续时间。植物似乎对HL胁迫的不同时间尺度具有不同的转录反应，特别是通过动态调节不同激素的生物合成，信号传导，光合作用和花色苷途径基因。在恢复过程中，约79％的HL DEGs的表达恢复到了非应激水平，其余的则没有恢复到非应激水平。这些未完全恢复的基因可能在植物的HL适应和HL胁迫记忆中发挥作用。与相关的转录组研究相比，本研究确定了许多不同的HL反应基因。对于这种观察，有几种可能的解释：（1）本研究包括72小时内的HL应激，而以前的研究仅研究了较短的时间。（2）植物遭受HL后处于不同的发育阶段。（3）本实验消除了热量作为变量，这使我们能够发现特定的高强度光催化下的转录组。此外，与高温和干旱转录组相比，大部分DEGs仅对每种胁迫都有反应，这意味着植物可能会使用不同的转录调节机制来应对不同的非生物胁迫。
本研究结果表明植物可能通过不同植物激素（例如ABA，JA和SA）的动态代谢对HL作出反应，这些植物激素被认为与光适应有关。从短期来看，ABA可能是触发对HL反应的信号。在不同的HL持续时间内持续高水平的ABA含量以及nced3nced5双突变体的HL超敏表型进一步表明ABA在中长期HL应激反应中的重要作用。
总之，研究者提出了一个假说，即植物如何通过光催化的转录网络响应不同的HL胁迫持续时间。在这种假说下，短时间暴露于HL后，植物开始激活一些途径，如ABA和JA生物合成，同时抑制核苷酸代谢和BR生物合成过程。中期HL后，花色苷开始积累，光合作用的基因被抑制。长期HL后，植物的生长受到影响，生长相关激素（如生长素和细胞分裂素）的生物合成受到抑制。但是，植物可以在相对较短的时间内从长期HL中恢复过来。本文提供的数据揭示了拟南芥中高强度光催化胁迫响应的全基因组动态转录趋势，这加深了研究人员对植物如何应对HL胁迫的认识，并提供大量的资源和候选基因，以评估基因参与HL胁迫反应。我们的研究还为植物中不同胁迫的比较转录组分析提供了资源。
评论
高强光胁迫植物的同时会传递热量，引起叶片表面温度升高，，因此前人研究往往忽视了温度的影响，本研究亮点在于：在HL胁迫下又同时消除热量的影响，通过较长期的不同生长时间点下的转录组分析，发现了一组由高强度光驱动信号特异性调节的基因，当变回正常光照时且大部分基因能够再短时间内恢复到正常表达水平。本文深入分析表明，植物通过动态调节激素对HL胁迫作出反应，展示了HL胁迫期间植物动态的和特定的高强度光催化的转录组。
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