载体原件

载体系统借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和PolyA信号等。

1.启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。

作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链延长因子基因的启动子（EF-1α）、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV和EF-1α启动子。外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言，也就是决定于特定的表达载体中的启动子，一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞，各启动子起始转录的效率有很大的差别，因此我们认为在进行外源基因的表达研究中，应考虑选用几种不同的强启动子，才有可能获得较为理想的表达效果。与启动子相连的是增强子元件，具种、组织特异性，CHO细胞中一般采用SV40和CMV增强子。

2.选择标记和基因扩增，CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。

一类是neo等非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影响，用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。 外源基因在CHO细胞中扩增是提高表达水平的重要策略之一。dhfr基因扩增系统最常用，当携带dhfr基因的表达质粒转染CHO细胞后，或携带dhfr基因的标志质粒与携带外源基因的表达质粒共转染CHO-dhfr-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，dhfr可被叶酸类似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不断提高MTX浓度，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系，结果会导致与dhfr串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。但它也有缺陷，表达细胞仅限dhfr缺陷型细胞，重复筛选抗性细胞费时费力，去除选择压力后，扩增基因不稳定。细胞遗传学表明，在选择压力下，扩增基因的大小和结构处在不断变化之中。在细胞分裂的不同时间，不同的宿主细胞和选择药物使基因的扩增范围处于不断变化之中，从100～1000kb。即使是同一种细胞，选择过程不同，基因扩增的范围也不同。谷氨酰胺合成酶（GS）扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率，但细胞长期连续培养时，生长状况不佳，DHFR系统表达水平虽较GS系统低，但细胞生长稳定。 基因扩增还可通过弱化选择标记基因表达来达到。弱化选择标记基因的表达，在使用与常规的表达载体相同的选择压力时，dhfr基因拷贝数更高，外源基因的表达水平也得到提高。如一种双顺反子载体将dhfr基因连在外源基因的3′端，从而位于外源基因3′端下游的dhfr基因的翻译起始效率大大降低，dhfr基因表达被弱化。另一种载体将dhfr基因插入人工合成的内含子内部，两边为剪接供体SD和剪接受体SA，外源基因在内含子的下游，mRNA剪切时，95%的dhfr mRNA被剪切掉。也有一些表达质粒不含选择基因，则必须共转染一个可表达选择基因的标志质粒，如pSV dhfr,该质粒由Psv2 dhfr去除SV40的增强子构建而成，起到弱化dhfr基因表达的作用。

其它 表达载体引入天然或人工合成的内含子序列，有利于外源基因组DNA转录的mRNA剪接内含子，增加稳定性，提高翻译效率，许多真核表达载体带有SV40的内含子。但因大多数插入的外源基因是cDNA，所以一般也用不着剪接信号。真核基因的mRNA加工需要多聚腺苷酸加尾信号（pA），实验表明，除去pA后，外源蛋白表达量降低90%。目前多采用SV40的晚期及早期pA、牛生长素基因的pA和人工合成的pA。

3.外源基因

启动子之后是克隆的基因组DNA或cDNA。基因组DNA比cDNA表达量要高，应尽量使用基因组DNA。除此之外，可以通过下列方法增加外源基因的表达量：(1)在基因起始密码子的前后设置Kozak序列，即GCCGCCA-3/GCCA UGG+4，其中最重要的是-3位的嘌呤，其次是+4位的嘌呤。具有Kozak序列与否，翻译起始强弱会有一个数量级的差异；(2)尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5′未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响，以及减少3′未翻译区对mRNA稳定性的不良影响； (3)拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌蛋白的输出等；(4)在不改变蛋白氨基酸序列的前提下，修饰个别基因的编码序列，解决密码偏性问题。实际表达中，可根据表达效果，对基因加以改造，以提高表达量。