流式细胞染色

下图是人PBMC用不同的细胞因子处理后，同时对表面标记(CD16和CD19)和细胞内标记(磷酸化STAT6)进行染色，并显示淋巴细胞亚群磷酸化水平的差异。显然，CD19+细胞在IL-4和IL-12刺激下出现明显的STAT-6磷酸化。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对部分CD19+细胞有轻微的磷酸化作用，而干扰素-γ(IFN-γ)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)不能诱导STAT6的磷酸化。CD16+细胞在刺激条件下STAT-6磷酸化没有明显变化。

这样的图，正是很多FLOWER梦寐以求的实验结果，只有这样区分出不同群体的磷酸化水平，才能定位到更精细的群体，更好揭示机制。

那么怎么才能做到呢？

我们上次在《流式细胞术做蛋白磷酸化检测的步骤和疑问》^[1] 中介绍了磷酸化蛋白的染色，但是只限于磷酸化蛋白的单染，因为甲醇破膜，对表面蛋白影响非常大，因此不适合表面标记和胞内磷酸化蛋白共染。有不少站友希望能够看到共染的Protocol，接着上次这篇Protocol继续。

主要试剂

大部分试剂和《流式细胞术做蛋白磷酸化检测的步骤和疑问》^[2] 是一样的，不同的部分在于破膜试剂，单染用的是甲醇，这里共染用的是0.2％的皂甙。

皂甙储存液配制：将10克皂苷(含≥25%皂素)与100mL PBS混合，制成10%的皂素原液。在37°C下放置，直到皂苷在温和搅拌下溶解。无菌过滤器(0.22μL)并保存在4°C。

磷酸盐洗涤缓冲液：PBS、1 mM β-甘油磷酸盐、1 mM原钒酸钠、1μg/mL微囊藻毒素和1 mM叠氮钠。

用上述两样试剂配制皂甙破膜工作液：

皂甙破膜工作液：磷酸盐洗涤缓冲液、0.2%皂苷、4%FCS，1 mM叠氮钠。在4°C下保存，4°C保存。

步骤

1.固定：往样本中加入高浓度甲醛溶液，使甲醛的最终浓度为1-2%，固定15分钟。2.用移液器充分吹打样本，然后将样本转移到流式管中，并将样品放在冰上。由于固定剂的存在，细胞容易粘附在塑料上，所以这一步吹打的时候要注意。转移完成后，通过显微镜检查培养板，确定细胞已被完全吸出，因为这是新手经常严重丢失细胞的环节。3.4℃，500g离心5分钟。4.在冰上操作，将细胞在200μL皂甙破膜工作液中破膜15分钟。5.离心沉淀细胞（500g，4°C，5分钟）。6.用皂甙破膜工作液重悬细胞，加入表面抗体和胞内磷酸化蛋白抗体。避光，4度，孵育1小时。7.PBS洗涤三次，以100ul PBS-EDTA重悬细胞，上机获取。

References

Krutzik PO, Trejo A, Schulz KR, Nolan GP. Phospho flow cytometry methods for the analysis of kinase signaling in cell lines and primary human blood samples. Methods Mol Biol. 2011;699:179-202. doi: 10.1007/978-1-61737-950-5_9. PMID: 21116984.