在细胞培养条件下稳定同位素标记（SILAC）实验中对前体进行同位素标记的动力学

摘要：质谱技术的发展提供了在蛋白质组层面分析细胞内蛋白质周转速率的手段。细胞培养条件下稳定同位素标记技术（SILAC）——一系列旨在量化被14C、15N标记的氨基酸与蛋白质结合速率标准化程序和试剂，大大促进了这些研究的进行。在SILAC实验中，通过测量不同时间蛋白质被同位素标记的程度，从而计算蛋白质周转速率。然而，蛋白质被同位素标记速率不仅仅受到细胞内蛋白质周转的影响，也受到氨基酸的吸收、循环，以及氨酰-tRNA合成的影响。为了估测这些过程对SILAC实验的影响，我们测量了细胞外15N标记的氨基酸引入后，在分裂和分裂阻滞的神经母细胞瘤细胞内，游离氨基酸和氨酰-tRNA前体池中同位素富集的速率。我们发现从细胞外进入细胞的氨基酸的总量大大超过了细胞内被循环利用或被合成的氨基酸的量。换言之，相比于细胞内的氨基酸来源，细胞外的氨基酸优先被用于合成用于蛋白质合成的氨酰-tRNA前体的底物。因此，在进行细胞培养的SILAC实验中，仅仅需要几个小时的时间就可以完成对氨酰-tRNA前体池中几乎全部的氨基酸进行标记，蛋白质周转的速率成为影响绝大多数蛋白质被标记速率的决定性因素。背景与目的SILAC技术是一种量化被标记的氨基酸进入蛋白质的程度与时间的关系，从而提供了一种在不进行纯化的前提下定量研究多种蛋白质降解动力学的方法。在SILAC实验中，往往在培养介质中加入15N标记的氨基酸，并测量细胞内蛋白质中同位素的富集程度与时间的对应关系。影响同位素富集的速率的因素主要有蛋白质周转速率和氨酰-tRNA前体池中的同位素丰度，由于前体池被标记的速率远大于蛋白质周转速率，后者常常被忽略。然而，前体池中15N的丰度并未被考虑。由于氨基酸的合成与循环，或细胞吸收外界氨基酸的速率较慢，都会使前体池中15N的丰度降低，从而导致新合成的蛋白质标记得不完全，使得测得的蛋白质周转速率比实际偏低。在本实验中，作者将设计实验讨论利用SILAC方法测定蛋白质周转速率的可行性。 实验原理1.当15N进入蛋白质时，蛋白质的相对分子质量增加，在质谱上表现为更大的质荷比。通过与t = 0时刻对比，检测相对分子质量发生变化的蛋白质的比例，便可以得到新合成的蛋白质在蛋白质总量中所占的比例。蛋白质被标记的比例对时间的导数——kclr，可以用来衡量原有蛋白质减少的速率。2. 通过测定同一种氨基酸的平均相对分子质量，确定15N占新合成的蛋白质中N元素的比例。由于氨基酸来源于前体池，因此可以通过新合成的蛋白质中的15N丰度反映前体池中15N的丰度。3.对游离的氨基酸中的同位素丰度进行测量，并与前体池中氨基酸的同位素丰度进行对比。两者的差别可以反映细胞对外源、内源的氨基酸的利用率存在差别，从而反映氨基酸的合成与循环对前体池标记程度的影响。 过程与结果作者首先对神经母细胞瘤细胞进行了培养。分别在细胞融合度为30%与细胞融合度达到80%的两天后将培养介质更换为同位素标记过的培养介质，并间隔一定时间采集两种细胞样品，得到了分裂细胞样品和分裂阻滞细胞样品。细胞样品经过清洗、溶解后离心分离出蛋白质。蛋白质经过处理后得到的多肽用于质谱分析。作者利用液相色谱-串联质谱法测量新合成的蛋白质中的同位素含量，从蛋白质组的层面分析了前体池的标记；利用气相色谱-质谱法测量细胞中游离的氨基酸中的同位素丰度。如图1-1、图1-3，细胞中未被标记的蛋白质的比例呈现出了指数式下降的趋势。对于分裂的细胞，kclr受到细胞分裂导致的稀释作用和蛋白质降解的影响。半衰期较短的蛋白质kclr主要取决于蛋白质周转速率，半衰期较长的蛋白质kclr还会受细胞分裂的影响。而对于分裂阻滞的细胞，由于不再存在细胞分裂导致的稀释作用，蛋白质被标记的比例直接反映了蛋白质降解的速率，进而反映蛋白质的半衰期。如图1-2、图1-4，无论是在分裂的细胞还是在分裂阻滞的细胞中，新合成的蛋白质中同位素的丰度都会很快地上升至90%或更高，这说明在SILAC实验中，前体池被标记的速率是十分迅速的。

对游离的氨基酸的分析（如图2）还表明，由于细胞内氨基酸的循环与合成产生未被标记的氨基酸，相比于前体池中的氨基酸，游离的氨基酸中的同位素丰度增加速率较小，当被标记的蛋白质也开始降解时，便释放出含15N的氨基酸使游离的氨基酸中的同位素丰度进一步增加。这说明了细胞在合成蛋白质时，优先利用从外界吸收的蛋白质。 结论与意义通过实验，作者证明了细胞吸收外界氨基酸的速率大于细胞内靠循环、合成产生氨基酸的速率，而且外源的氨基酸被优先用于蛋白质合成。因此，前体池中15N的丰度会很快接近100%，影响蛋白质标记速率的因素是蛋白质周转速率。在SILAC实验中，除半衰期很短的蛋白质外，其余蛋白质的周转速率都可以用SILAC实验来测定。对于半衰期太短的蛋白质，则需要新的方法对其周转速率进行研究。

评论与体会1.这是一篇探究SILAC实验可行性的文献。结合本学期对于分析化学的学习，我认为在化学实验中，对分析方法的准确度、精确度、可重复性有着一定的要求。对于一种新的分析方法，需要设计巧妙的实验以验证该方法的可行性。2.传统的同位素示踪法大多数应用了放射性同位素，通过对放射性的检验对底物进行示踪。而本文中作者使用了稳定同位素，利用质谱中质荷比的不同，不仅仅追踪了标记物，还可以相对准确地定量分析同位素的丰度。3.作者很好地利用了质谱信息，通过质谱信息推理出实验过程的许多细节。这种能力是科研工作者必须具备的，我在今后的学习中应当有意识地培养做假设、逻辑推理能力。4.结合近期查阅过的文献，越来越多的化学文献中出现了化学生物学的内容。化学生物学的发展体现了未来交叉学科发展的一种趋势。我认为在今后，除了要多关注新发表的文献以外，还应当打好生物、物理等其他学科的基础。