小分子药物的聚乙二醇修饰
背景介绍
聚乙二醇（PEG）是经环氧乙烷聚合而成的，相对分子量在200～8000或者8000以上的乙二醇高聚物，其由重复的氧乙基组成，不仅具有良好的水溶性，也能溶于苯、乙腈和乙醇等有机溶剂。聚乙二醇分子特性如下：①分散度低：相对分子质量(Mr )小于 5000的分散度为1.01，大于5000的分散度为1.1，且分布较广，有较大的选择性；②独特的两亲性：独特的结构使得它既溶于有机溶剂也溶于水；③无免疫原性：即使分子量高达5.9×106Da，本身的免疫原性也很低。临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗未发现抗聚乙二醇抗体产生；④无毒性：研究表明 大于1000的聚乙二醇是无毒的，且已在各种食品、化妆品和药物中被使用；⑤可生物降解：聚乙二醇在体内不经过任何结构变化而直接被清除，分子量小于20000的通过肾脏代谢，更大分子的则可经过消化系统代谢。
聚乙二醇修饰的药物特点
多数蛋白质类药物、多肽类药物以及化学药物在发挥其作用时，都伴随着一些自身无法克服的问题，如作用周期短、较大的免疫原性以及毒副作用。而聚乙二醇中性、无毒、具有独特的理化性质和良好的生物相容性，并且是少数被FDA批准可用于体内注射用药的化学物质。因此，将活化的聚乙二醇通过化学方法连接到蛋白质、多肽、小分子药物及脂质体上，即进行药物分子的PEG化，便可有效提高药物分子的生物半衰期并降低其毒副作用。其中，研究最多的是蛋白质的PEG修饰。早在20世纪70年代，Davies和Abuchowsky等人便发现经过PEG修饰的蛋白质疗效优于未经修饰的原型药物。当聚乙二醇偶联到药物分子表面时，便将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变他们在水溶液中的生物分配行为以及溶解度，并在其所修饰的药物分子周围产生屏障，降低药物分子的酶解，避免在肾脏的代谢中被很快消除，并使药物分子被免疫细胞所识别。因此经过PEG修饰的蛋白质药物与未经修饰的蛋白质药物相比总结优势如下：(1)更强的生物活性；(2)脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用；(3)更长的半衰期；(4)较低的最大血药浓度；(5)血药浓度波动较小；(6)较少的酶降解作用；(7)较少的免疫原性及抗原性；(8)较小的毒性；(9)更好的溶解性；(10)用药频率减少；(11)提高病人的依从性，提高生活质量，降低治疗费用。
图1 PEG修饰对药物性质的改善
表1 已上市的PEG修饰药物
PEG修饰方法
鉴于PEG修饰对药物性质产生的巨大影响，PEG修饰成为药物研发以及已上市药物药效改善的重要途径。那么，如何进行PEG修饰则成为重中之重。
首先，需要选择合适的PEG来进行分子修饰。对修饰剂的选择主要考虑以下5个方面：(1)PEG相对分子质量（Mr）的选择要综合考虑生物活性和药代动力学两方面的因素。应用过大的PEG修饰蛋白药物会导致药物丧失绝大部分的生物活性。而使用低Mr (<20000)的PEG修饰蛋白药物，修饰后的蛋白药物较原型药物在生物活性和药代动力学性质上没有本质改变，所以，一般选择在40000- 60000范围内的PEG作为修饰。(2)修饰位点的选择要根据蛋白质构效关系分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。常用的修饰位点有氨基修饰、羧基修饰和巯基修饰；(3)PEG修饰剂与氨基酸反应的特异性依赖于修饰剂的化学性质与修饰位点的选择。目前常见修饰剂见表2；(4)PEG修饰剂的水解稳定性和反应活性取决于活化基团的稳定性和修饰反应的条件控制，特别是pH的控制。一般来说，PEG修饰剂的反应活性高，则其稳定性就差，容易水解；(5)PEG修饰后的蛋白活性、毒性和抗原性与PEG的大小和修饰类型有关。一般随着PEG 的Mr的增大，蛋白的活性损失也逐渐增加，另外不同的PEG修饰剂对蛋白的生物活性影响不同。
表2 定点修饰的新型PEG修饰剂
其次，将PEG进行活化。PEG修饰蛋白质主要通过PEG末端羟基与蛋白质氨基酸残基反应实现，而PEG末端羟基活性很差，必须使用活化剂对其进行活化，才能在体内温和的条件下对蛋白质进行共价修饰。常用的PEG活化方法有：
（1）羰基二咪唑法：该方法最早用于多肽的合成，被证明是形成酰胺键的良好试剂。
图2 羰基二咪唑法活化PEG
（2）N-羟基琥珀酰亚胺法： (a)N,N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化，此反应也需要在无水条件下进行。（b）琥珀酸酐及 N-羟基琥珀酰亚胺活化，该方法活化得到的聚乙二醇活性较高，最好是在非水环境中进行蛋白的偶联。
图3 N,N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化PEG
图4 琥珀酸酐及 N-羟基琥珀酰亚胺活化PEG
（3）氰脲酰氯法：氰脲酰氯又名三氯化嗪(TST) 是对称杂环化合物，David 等利用 TST 与聚乙二醇上的羟基反应 只有一个氯原子被取代，其它的氯原子与蛋白质的氨基反应。
图5 氰脲酰氯法活化PEG
（4）光气参与的活化方法：Kurfuerst 等在其专利中提到一些方法，分别用 N-羟基琥珀酰亚胺钾盐、硝基苯酚及三氯苯酚与光气反应制备活化聚乙二醇。活化主要分两步如下图所示。
图6 光气法活化PEG
（5）聚乙二醇对蛋白质的半胱氨酸残基的化学修饰，常见特异性修饰疏基的PEG活化方法如下图。
图7 特异性修饰疏基的PEG活化方法
（6）酶法定点连接聚乙二醇：除了传统的化学修饰方法，也可以通过其它途径如酶催化来达到修饰的目的，以谷氨酰胺酶（G-TGase）为例。
图8 酶法定点连接聚乙二醇
最后，选择合适的蛋白质氨基酸残基位点或小分子药物位点进行定点修饰。用活化后的PEG对合适的蛋白质氨基酸残基进行定点修饰，从而改善天然蛋白质的疗效。蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一，给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点，科研人员在用PEG进行修饰时，根据蛋白质的构效关系进行分析，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，这样修饰后的蛋白药物除具有PEG修饰所带来的优良性质外依然具有较高的生物活性。目前，已上市药物中常见的修饰位点有氨基、羧基、疏基、二硫键、糖基以及非极性氨基酸某些特定位点的修饰。
（1）定点修饰氨基
蛋白质分子表面的氨基有较高的亲核反应活性, 因而是蛋白质化学修饰中最常被修饰的基团。姚文兵等人以不同浓度的PEG修饰后的人干扰素α-2b和人干扰素α-2b对人肝癌细胞(SMMC-7721)、人红白血病细胞(K562)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人鼻咽癌细胞(KB) 和人胃癌细胞(BGC)的生长产生的抑制作用进行比较, 发现PEG修饰后的人干扰素的抗肿瘤细胞增殖作用优于修饰前。
图9 PEG5000定点修饰人干扰素α-2b氨基反应方程
（2）定点修饰羧基
有一些蛋白的N端对其生物活性起着重要作用,如果在N端实施PEG修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将PEG修饰的位点转移至C端则是一种有效的修饰策略。豪森自主研发的长效GLP-1受体激动剂-聚乙二醇洛塞那肽则是在艾塞那肽的基础上，对其末端氨基酸的羧基进行PEG修饰，延长药物半衰期，最终实现一周一次皮下注射给药即可平稳有效控制血糖水平。成为国内首个自主研发的长效GLP-1受体激动剂。
图10 孚来美结构图
(3)定点修饰疏基
目前，可用于疏基修饰的mPEGs包括mPEG-马来酰亚胺、mPEG-邻吡啶-二硫醚、mPEG-乙烯基砜以及mPEG-碘乙酰胺等。Goodson等人通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点, 采用马来酰亚胺活化的PEG (PEG-maleimide)对其进行修饰, 反应方程式如下图所示.结果表明, PEG-Cys-rIL-2 与rIL-2具有几乎相同的生物活性, 而前者在体循环中的滞留时间是后者的4倍。此外，新上市的A型血友病新药BAY94-9027也是通过用PEG修饰引入蛋白中的疏基从而发挥药效。
图11 PEG定点修饰白介素反应方程
(4) 定点修饰二硫键
目前，已上市药物中的赛妥珠单抗便是通过PEG定点修饰抗原结合区的二硫键延长半衰期，从而发挥更持久药效。Khalili 等合成了PEG-双砜试剂，能特异性地将二硫键末梢定位到 Fab 的结合区，其与赛妥珠单抗的结合延长了赛妥珠单抗血浆消除半衰期，该药批准的适应症为克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和强直性脊柱炎。
(5）PEG修饰小分子药物
经过几十年的研究，已有很多聚乙二醇修饰小分子药物进入临床研究状态。聚乙二醇修饰小分子药物的应用较为广泛，其中最具代表性的是紫杉醇类和喜树碱类。研究较多的还有各类常用的结构较为简单的抗肿瘤药物及较少的几种非抗肿瘤药物。
A 吉西他滨（Gemcitabine）
吉西他滨用于治疗不能手术的晚期或转移性胰腺癌及局部进展性或转移性非小细胞肺癌，以及膀胱癌、乳腺癌及其他实体肿瘤，是应用非常广泛的一线化疗药物。但该药物半衰期短，毒性大，这大大限制了该药物的临床应用。为了突破这些限制，Pasut等以聚乙二醇作为连接臂，将吉西他滨和叶酸偶联起来，以提高药物的靶向性。他们以一端为氨基一端为羧基的聚乙二醇为原料，叶酸的羧基与聚乙二醇的氨基偶联后得到叶酸一聚乙二醇偶联物，该物质与吉西他滨偶联。该目标物在不同pH值缓冲液及血浆中的稳定良好，且药动学研究表明，偶联物的清除降低，半衰期明显延长，生物利用度明显提高。
目前，PEGPH20 +白蛋白结合型紫杉醇（nab-paclitaxel）/吉西他滨与白蛋白结合型紫杉醇/吉西他滨在未经治疗的转移性胰腺导管腺癌患者中的随机研究已进入到II期。
B 表柔比星（Epirubicin）
表柔比星属于抗生素类抗肿瘤药，通过直接嵌入DNA碱基对，干扰转录过程，阻止mRNA的形成，从而抑制DNA和RNA的合成。临床上用 于治疗急性白血病和恶性淋巴瘤等多种实体瘤。但该药物对肝脏毒性较大，为了减轻毒性，研究者们对其进行了各种修饰。Pasut等研究了表柔比星的聚乙二醇修饰。一氧化氮可以提高表柔比星的活性，将表柔比星和一氧化氮释放因子连接起来以达到增加药效、提高生物利用度的目的。该实验以一端为羧基、一端为羟基的聚乙二醇为原料。先将聚乙二醇的羟基活化后与表柔比星偶联，然后活化聚乙二醇的羧基端与氨基酸反复多次偶联，最后利用氨基酸暴露的羧基与一氧化氮释放因子偶联得到目标产物。体内实验表明，其抗肿瘤活性明显高于未修饰的表柔比星。
C 喜树碱
喜树碱是从我国喜树中提取的一类植物抗癌药物，其中喜树碱和高喜树碱都已被美国FDA批准上市，用于治疗结肠癌和非小细胞肺癌。但其毒性大，尤其是对胃肠道。
Fleming等将分子量为3400的聚乙二醇通过各种类型的连接与喜树碱的2位羟基偶联，并考察了其在不同pH值磷酸盐缓冲液中的稳定性。结果表明，其水解速度最少降低至1／5。体外毒性实验考察了药物在神经胶质瘤细胞中的毒性，结果表明偶联物有一定的细胞毒作用，但IC值高于游离的喜树碱。但从药代动力学角度，考虑到缓释作用，综合的IC值高于游离喜树碱的。在雄性FISHE小鼠体内实验中，对不同给药时间的小鼠脑组织进行取材，通过免疫组化分析方法，证明了偶联物在大脑中蓄积的浓度远低于游离喜树碱，但可以存在较长时间。表明偶联物在体内可以达到缓释的效果 。
D PEG-伊立替康 (NKTR-102)
NKTR-102是将4支链的PEG偶联到伊利替康的羟基上，且伊利替康的活性代谢产物是活性抗癌剂SN-38。该偶联物在小鼠血浆中的半衰期为15d，而伊利替康只有4h，相比之下提高明显。I期临床研究中， 注射该药物后 ，血液中蓄积的SN-38的量是注射伊利替康后的1.2-6.5倍。每3周注射一次的最大致死量为115mg／m2。毒性反应都在可控范围内。与5- 氟尿嘧啶联合用药治疗实体瘤已进入I期临床。治疗转移性乳腺癌已进入III期临床。在2015年发表的一项三期临床试验中，与医生选择的单药治疗晚期乳腺癌患者相比，NKTR-102并没有改善患者的总体生存率。但值得注意的是，该试验中的患者接受了大量的预处理，并患有局部复发或转移性乳腺癌，而且NKTR-102可能会为晚期乳腺癌患者提供生存益处。对一部分有脑或肝转移病史的患者使用昂泽尔德仍有生存益处，目前正在对这些患者进行III期临床试验。
E PEG-纳洛酮 (NKTR-118)
阿片样药物一般用于缓解病人在医疗事件中遭遇的各种严重疼痛，但阿片样药物会使小肠和空肠运动迟缓而引起便秘，尤其是长期使用阿片样药物的病人。纳洛酮属于阿片受体拮抗剂，主要用于解救麻醉性镇痛药急性中毒，拮抗这类药的呼吸抑制，以及解救急性乙醇中毒。但纳洛酮口服无效，须注射给药，且吸收迅速，易透过血脑屏障，代谢很快，在人体内血浆半衰期为30～78min，需要持续给药。PEG一纳诺酮利用小分子偶联技术，将为分子量为340的支链PEG与纳洛酮偶联，降低了纳洛酮进入中枢神经系统的能力，延长了半衰期。因此，该药在降低纳洛酮抗阿片类镇痛的能力的同时显著改善阿片类药物导致的便秘现象。NKTR-118是口服的片剂，只须每天给药一次，相比须静脉给药的钠洛酮，减少了给药频率和给药难度，给病人和医生都带来极大的便利。临床研究表明PEG-纳洛酮克服了纳洛酮半衰期短的缺点。这款药物已于2014年获得临床批准。
修饰后药物的分离纯化
获得PEG-药物复合物后，为避免复合物中含有的其他杂质对药效产生不利影响，便需要将其进行分离纯化得到单一复合物，常用方法有沉淀法、膜过滤法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、疏水层析和反相色谱法。
前景和展望
目前，PEG修饰药物主要为不可逆性的第一代PEG-药物复合物和通过可断裂键连接药物从而发挥缓释作用的第二代可逆性PEG-药物复合物[6]，而第一代小分子药物偶联物增强了先前批准的小分子药物的药代动力学和药效学性质，由于它们的非生物降解性和对分子质量的限制，第一代聚乙二醇-药物偶联物的药物动力学改善并不是十分理想，因此，除了已进行了较多研究的多肽小分子偶联药物，目前的研究工作集中在使用新的生物可降解和脊椎可降解水溶性聚合物的偶联物的评价。可降解的高分子量N-(2-羟甲基)甲基丙烯酰胺（HPMA）聚合物小分子药物偶联物表现出改善的药代动力学和药效学，同时表现出最终的肾脏清除率。类似地，新的水溶性、生物相容性和生物可降解聚合物，如聚碳酸酯，也正在合成和评估中，扩大了可用于药物偶联的聚合物的种类。聚乙二醇化的未来是面向第三代的聚乙二醇化，其目的是实现最高的效能和延长药物分子半衰期，位点特异性和低剂量。可通过静电连接的非共价PEG修饰实现。如果成功实现，在进一步研究的帮助下，聚乙二醇化具有成为蛋白质治疗主要方法的潜力。
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