多组学技术揭示人视网膜调控动力学
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总 览
源自人类诱导的多能干细胞（hiPSC）的视网膜类器官（RO）为研究人类视网膜发育和疾病提供了可用的样本。ROs能在多大程度上模拟出人类视网膜发育的表观遗传特征尚不清楚。在这项研究中，作者系统地剖析了长期人类视网膜和RO发育过程中的染色质可及性和转录组动力学。结果表明，ROs在很大程度上模拟了人类的视网膜生成，也发现了人与小鼠视网膜发育过程中不同的染色质特征。人类视网膜研究的最新进展为发育中的人类视网膜提供了有价值的基因表达和表观遗传信息
测序技术
RNA-seq；ATAC-seq
样本
妊娠第6周至25周9个时间点的发育中的人视网膜样本（GW6, GW10, GW11, GW12, GW14, GW15, GW20, GW24, GW25）；
0至30周hiPSC诱导的ROs（w0, w2, w4, w6, w10, w15, w23, w30）
主要结果
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发育中人类视网膜和ROs的染色质可及性图谱
作者分析ATAC-seq结果以获得染色质可及位点。样品的相关性分析发现样品数据质量高并且重复性好。作者对ATAC-seq峰强度进行了相关分析，以定义人类视网膜与RO之间的染色质可及性相似性。结果表明人类视网膜和RO在染色质可及性方面与发育相关。主成分分析(PCA)显示，人视网膜和ROs的发育轨迹在时间上相关。接下来，作者进一步研究染色质可及性是否与基因表达变化相关。作为阳性对照，发现在RCVRN基因推断的启动子和增强子位点ATAC-seq和DHS-seq信号富集的增加，与该阶段基因表达一致。总的来说，这些数据表明RO分化在很大程度上能反映人类视网膜的发育过程。
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染色质可及性反映了人类视网膜和ROs的发育转变
为了描述表观基因组动力学如何控制人的视网膜发育，作者在不同的发育时间点对人视网膜和ROs的ATAC-seq信号进行成对比较。在整个基因组中发现了10,563个不同的DNA可及位点（来自人类视网膜的8805个元素和来自ROs的10,160个），并通过无监督的层次聚类确定了五个不同的调控元件簇。为了了解这些显著差异峰的功能，使用GO富集分析，peaks主要富集在神经系统发育。
作者还对发育中的人类视网膜和ROs的RNA-seq分析进行了成对比较。在RNA序列数据中确定了不同的G1至G4簇。G1簇中的基因与早期发育过程有关。G2基因与轴突指导和神经元投射发育的调节有关。G3中的基因与视觉感知和光转导有关。G4基因显示出视网膜发育的非特异性生物学过程，因此，G4未用于进一步分析。因此，RNA-seq数据的GO项（G1至G3）揭示了人类视网膜与RO之间相似的连续视网膜发育。为了进一步比较视网膜发育过程中的人类视网膜和RO转录组，对来自人类视网膜的3235个差异表达基因（DEG）进行了开放式动态时间扭曲（OE-DTW）分析（图D）。作者观察到人类视网膜（GW7至GW20）与ROs（w0至w23）之间存在紧密的时间相关性，从而证实了人类视网膜和ROs在基因表达变化方面具有相当大的相似性。
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鉴定涉及人类视网膜发育的潜在转录因子（TFs）
为了确定人视网膜发育相关的潜在TFs，作者使用软件HOMER v4.8进行检索，数据揭示了不同集群中TFs的不同模式。富含C1和C2峰的TF被确定为早期视网膜发育的潜在调节因子。例如，PAX6是用于维持RPC多能性的关键调节器。 SOX3和RUNX以自我更新维护和形态发生而闻名。从C4和C5 ATAC-seq峰富集的TFs被分别确定为神经元和感光细胞分化的关键调节因子。例如，簇C4富含VSX2，SMAD2和NEUROD1，它们对于视网膜神经发生很重要。 C5富含OTX2，CRX和NR2E3，它们是感光细胞分化的关键调节因子。RPC分化和细胞命运确定需要OTX2。CRX是光感受器存活和分化的关键调节剂。NR2E3是NRL的直接靶标，它参与了啮齿类动物的视杆和视锥细胞感光细胞的分化。因此，根据ATAC-seq数据预测的TF与视网膜发生和分化高度相关。
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人类视网膜发育过程中TFs调控网络的预测
TFs通常在网络中通过相互交互来调节基因转录。为了建立TFs的潜在联系，作者在人类视网膜和RO发育过程中重建了TF调控网络的全局图。首先，作者使用HOMER v4.8来识别与C1至C5峰结合的富集TFs。TFs之间的连接（边缘）定义如下：如果TF-X的基序位于TF-Y的启动子上，则TF-X调节TF-Y，从而从TF-X指向TF-Y的箭头。在此，仅考虑此时明确表达的TF。根据这个规则，作者分别在早期，中期和后期分别构建了人类视网膜（GW6，GW10和GW20）和RO（w6，w10和w23）的转录调控网络。
总结
作者对人类视网膜发生在体内和体外ROs分化过程中染色质可及性和转录变化的进行了全面分析，揭示了阶段特异性染色质动力学，可调节人类视网膜发生与转录组变化相一致。发现了TFs对人类视网膜发育的影响。极大地拓展了对人类视网膜发育的认识，对今后的研究提供了有力支持。