一种黄芪多糖的提纯方法与流程

本发明涉及提纯
技术领域：
，特别是一种黄芪多糖的提纯方法。
背景技术：
：黄芪，豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，春、秋二季采挖，除去须根和根头，晒干。味甘,性微温，具有补气升阳，生津养血，利水消肿，固表止汗，行滞通痹等功效。用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛等症。黄芪主要成分为黄芪多糖、皂甙、黄酮、维生素、微量元素，其中黄芪多糖、皂苷类成分、黄酮为多种药理作用的有效成分。其中对黄芪多糖的研究报道比较多。近年来，从自然资源中分离和研究具有保健作用的新型生物活性成分引起了很大的兴趣。黄芪，是比较受欢迎的促进健康的中药材之一，干燥根历来被用作免疫调节剂，用于治疗感冒，腹泻，乏力和食欲不振，已经有超过了2000多年的历史。现代植物化学和药理实验证明，黄芪多糖是黄芪根的主要活性成分之一，具有各种重要生物活性，例如免疫调节，抗氧化，抗肿瘤，抗糖尿病，抗病毒，保肝，抗发炎，抗动脉粥样硬化，造血和保护作用。多糖又称多聚糖，是由醛糖或酮糖通过脱水形成糖苷键，是由糖苷键线性或分枝连接而成的链状聚合物。据报道黄芪多糖中蛋白质含量高于15％，所以除去蛋白质是多糖提取纯化的一个关键步骤。脱蛋白的方法主要有蛋白酶解法、sevage法、三氯乙酸法及盐析等方法。单用蛋白酶脱除蛋白，作用比较温和，但受到酶专一性的限制及后续处理麻烦；单用Sevage法不仅使用大量的有机试剂并且会损失一部分糖蛋白；因此，黄芪多糖提纯方法的改进和创新是目前亟需解决的问题。技术实现要素：针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种黄芪多糖的提纯方法，可有效解决黄芪多糖的提纯问题。本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：1）黄芪多糖提取：将干燥的黄芪饮片粉碎过2号筛，水提，固液比1:12-1:20提取多糖，回流提取60-90min，过滤，收集滤液，重复提取三次，合并滤液，将提取液浓缩至120-200mL，加入提取液4-6倍体积的无水乙醇，密封沉淀16-24h，重复三次，下层水浴烘干，得粗提物，冷冻干燥，备用；2）脱蛋白：将0.2g粗提物冻干粉溶解于50-100mL蒸馏水中（pH4.5-7.0），加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量为粗提物冻干粉重量的0.75-5.0%，在35-70℃酶解4-24h，然后与15-30mLsevage试剂混合，静止5-15min分离，取上层清液，重复两次，水浴烘干，冻干后测定多糖与蛋白含量。所述的sevage试剂是氯仿︰正丁醇=4︰1。本发明为能更彻底地除去多糖中的蛋白质，不会破坏多糖的结构，并且减少了有机试剂的用量，提高了除蛋白质效率，同时也提高了多糖纯度，是黄芪多糖提纯方法上的创新。附图说明图1为本发明黄芪多糖脱蛋白的酶解时间考察结果图（●多糖含量；◆蛋白质含量）。图2为本发明黄芪多糖脱蛋白的酶底比考察结果图（●多糖含量；◆蛋白质含量）。图3为本发明黄芪多糖脱蛋白的酶解PH考察结果图（●多糖含量；◆蛋白质含量）。具体实施方式以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。实施例1本发明在具体实施时，包括以下步骤：1）黄芪多糖提取：将干燥的黄芪饮片粉碎过2号筛，水提，固液比1:13提取多糖，回流提取70min，过滤，收集滤液，重复提取三次，合并滤液，将提取液浓缩至130mL，加入提取液4倍体积的无水乙醇，密封沉淀16h，重复三次，下层水浴烘干，得粗提物，冷冻干燥，备用；2）脱蛋白：将0.2g粗提物冻干粉溶解于pH值为4.5的60mL蒸馏水中，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量为粗提物冻干粉重量的1.0%，在35℃酶解6h，然后与16mLsevage试剂混合，静止6min分离，取上层清液，重复两次，水浴烘干，冻干后测定多糖与蛋白含量。实施例2本发明在具体实施时，包括以下步骤：1）黄芪多糖提取：将干燥的黄芪饮片粉碎过2号筛，水提，固液比1:15提取多糖，回流提取80min，过滤，收集滤液，重复提取三次，合并滤液，将提取液浓缩至160mL，加入提取液5倍体积的无水乙醇，密封沉淀20h，重复三次，下层水浴烘干，得粗提物，冷冻干燥，备用；2）脱蛋白：将0.2g粗提物冻干粉溶解于pH值为5.0的70mL蒸馏水中，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量为粗提物冻干粉重量的2%，在50℃酶解12h，然后与25mLsevage试剂混合，静止10min分离，取上层清液，重复两次，水浴烘干，冻干后测定多糖与蛋白含量。实施例3本发明在具体实施时，包括以下步骤：1）黄芪多糖提取：将干燥的黄芪饮片粉碎过2号筛，水提，固液比1:20提取多糖，回流提取90min，过滤，收集滤液，重复提取三次，合并滤液，将提取液浓缩至200mL，加入提取液6倍体积的无水乙醇，密封沉淀24h，重复三次，下层水浴烘干，得粗提物，冷冻干燥，备用；2）脱蛋白：将0.2g粗提物冻干粉溶解于pH值为7.0的100mL蒸馏水中，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶用量为粗提物冻干粉重量的5.0%，在70℃酶解24h，然后与30mLsevage试剂混合，静止15min分离，取上层清液，重复两次，水浴烘干，冻干后测定多糖与蛋白含量。本发明方法对黄芪多糖的提纯方法进行了单因素与正交试验考察，以多糖含量与蛋白脱除率为考核指标，获得了黄芪多糖的优化提纯方法，经实际应用和测试，与试验测试结果相一致，表明方法稳定可靠，黄芪多糖提纯效果好，具体试验资料如下：1、黄芪多糖脱蛋白的单因素考察：1.1酶解时间的考察：精密称取5份200.0mg的样品（粗提物冻干粉），分别加入PH为7.00的溶液超声溶解，定容置100mL的容量瓶中，分别加入2.00mL浓度为1.00mg·mL-1木瓜蛋白酶溶液，在温度50℃的条件下保温酶解，对酶解时间进行考察，分别酶解4，6，8，12，24h，再分别用sevage法萃取2次，离心后取上层的多糖溶液置干净的蒸发皿中，水浴挥干溶剂后冷冻干燥24h，然后采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法测定多糖和蛋白质的含量（如图1所示）。1.2酶底比的考察：精密称取5份200.0mg样品，用PH为7.00的溶液溶解定容置100mL的容量瓶中，对酶底比进行考察，分别加入浓度为1.00mg·mL-1木瓜蛋白酶溶液1.50，2.00，2.40，4.00，5.00mL，在温度50℃的条件下保温酶解8h，再分别用sevage法萃取2次，取上层的多糖溶液再离心后置蒸发皿中，水浴挥干溶剂后冷冻干燥24h，然后采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法测定多糖和蛋白质的含量（如图2所示）。1.3酶解PH的考察：精密称取5份200.0mg样品，对酶解PH进行考察，分别用PH为4.50，5.00，5.50，6.00，7.00的溶液溶解定容置100mL的容量瓶中，分别加入浓度为1.00mg·mL-1木瓜蛋白酶溶液2.00mL，在温度50℃的条件下保温酶解8h，再分别用sevage法萃取2次，取上层的多糖溶液离心后置蒸发皿中，水浴挥干溶剂后冷冻干燥24h，然后采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法测定多糖含量和蛋白质的含量（如图3所示）。2、黄芪多糖脱蛋白的正交试验根据所做单因素水平试验结果，选择酶解时间、酶底比、温度、PH为考察因素，进行L9（34）的正交试验，各因素的水平设计如表1。精密称取黄芪粗多糖九份，每份200.0mg，分别按L9（34）表中给出的条件进行酶解相应的时间，再分别用sevage法萃取2次，离心后取上层的多糖溶液置蒸发皿中，水浴挥干溶剂后冷冻干燥24h，再分别称取10.0mg，蒸馏水溶解定容置100mL的容量瓶中，用紫外分光光度计在波长595nm处检测蛋白质含量，在波长490nm处检测黄芪多糖的含量。根据以下正交试验设计表，按照设计好的工艺进行试验。以多糖的含量和蛋白质的脱除率为指标，两者重要程度相等，采用综合评分法对两种指标进行评分后，用正交设计软件处理得到黄芪多糖的含量结果和方差分析结果，其结果见表1和表2。由方差分析结果可知，影响黄芪多糖脱蛋白质效率的各因素主次关系为D>C>A>B，因素C、D具有显著性影响，因素A、B影响较小。正交试验分析得出脱蛋白的最佳组合为A3B3C2D1，即酶底比为2.00%，pH值为5.00，50℃水浴酶解24h，黄芪多糖的蛋白脱除率89.82%，多糖的含量83.48%。表1黄芪多糖脱蛋白的正交试验分析No.A酶解时间/hB酶底比/%C温度/℃D/pH多糖含量/%蛋白质脱除率/%综合评分/%180.7540574.8391.19166.02281.0050675.1092.57167.67382.0060777.3281.83159.154120.7550777.9083.62161.525121.0060582.8082.52165.326122.0040677.1586.38163.537240.7560676.4987.20163.698241.0040770.8088.72159.529242.0050583.4889.82173.30K1492.84491.23489.07504.64K2490.37492.51502.49494.89K3496.51495.98488.16480.19R6.144.7514.3324.45表2综合评分方差分析因素SSfMSFPA6.36323.1821.580>0.05B4.02722.013C42.919221.46010.658>0.05D100.995250.49825.080<0.05注：F0.05（2，2）=19.00。本发明具有如下优点：(1)从植物中提取的多糖大多数含有大量的蛋白质，影响多糖的纯度，所以除去多糖中的蛋白质是多糖纯化的重要步骤。目前，多糖除蛋白主要有Sevage法、三氟乙酸法、盐酸法、酶法等方法，单用酶法，虽然安全、高效但是受到酶专一性的影响，对除去植物多糖中的蛋白质也有一定的限制条件，且必须有后续多糖蛋白的分离程序。单用sevage法只能除去游离水溶性的蛋白质，并且有机试剂的用量比较大，比较费时费力，而且对人体有害。本发明采用酶-Sevage法结合,多糖溶液经过酶的酶解,游离蛋白质及部分与多糖结合的蛋白质被酶解,在酶的作用下，分解结合的糖蛋白，使其大量的蛋白质游离，然后使用Sevage法除去游离的蛋白质，这样便能更彻底地除去多糖溶液中的蛋白质，同时也提高了多糖的纯度，仅需少量的有机试剂,即可达到去除蛋白的良好效果,降低了有机试剂的使用量和多糖损失量。本发明创造性的将两种方法连用，不仅可以除去大量的蛋白质，不会破坏多糖的结构，并且减少了有机试剂的用量，提高了除蛋白质效率，同时提高多糖纯度，是黄芪多糖提纯方法上的创新。(2)本发明对黄芪多糖除蛋白的提纯方法进行了研究，采用水提醇沉的提取方法提取黄芪多糖，以蛋白质的脱除率和多糖的含量为指标，通过单因素考察和正交试验设计，并利用综合评分法对实验结果进行分析，本发明系统研究了黄芪多糖的脱蛋白提纯方法，试验设计结合单因素与正交试验设计，使得优化提纯方法更接近实际、更具可行性，具有良好的推广和应用价值。当前第1页1 2 3