自建队列简单分析发7+分思路
Comprehensive RNA Sequencing in Adenoma-Cancer Transition Identified Predictive Biomarkers and Therapeutic Targets of Human CRC腺瘤-癌转移的全面RNA测序确定了人类CRC的预测生物标志物和治疗靶标
一、研究背景
结肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，在中国发病率和死亡率不断增加。对于结肠癌的发生，从腺瘤向癌的转变被认为是至关重要的，这之中还包括多种遗传和遗传表观遗传学危险因素。近几年，研究人员发现高达90％的CRC病例经历了从腺瘤向癌的转变这一过程。因此，不少人认为这一发现为早期筛查和预防CRC提供了机会。
二、研究流程
三、结果解读
1、候选circRNA，miRNA和mRNA的表达谱
图1.RNA的鉴定和层次聚类分析
图S1. RNA重叠的Venn图
在邻近的正常组织和腺瘤组织中，作者鉴定出575种差异表达的circRNA（DEC），243种差异表达的miRNA（DEM）和3,950种差异表达的mRNA（DEG）。而在邻近的正常组织和癌症组织，仅有 171种DEC，53 种DEM和506种 DEM。（如图1A-1F）
紧接着，作者通过层次聚类分析探索了各组之间共同表达的RNA的表达模式。与邻近的正常组织相比，大多数共同表达的RNA在腺瘤和CRC组织中表现出相似的表达模式（图1G-1I）。
2、功能富集和PPI分析
图2.候选DEG的功能富集
图3.候选DEG的PPI网络
为了探索共同表达的DEG的主要生物学功能，作者进行了GO和KEGG通路富集分析。作者发现在前30个富集的GO terms和KEGG途径中（图2），基因沉默的调节，DNA损伤检查点，细胞周期，p53信号通路等都与肿瘤发生有关。
紧接着，作者通过PPI分析来确定共同表达的DEG中的重要中枢基因，并生成了具有301个节点的网络（图3A）。同时，作者发现总共有180个基因（例如CASP8，TNS1，CXCL1等）与五个以上的其他基因相互作用。然后作者使用CytoNCA来计算每个节点的程度，图3B中显示了具有前50个基因的子网。
3、 miRNA-mRNA相互作用和circRNA相关的ceRNA网络分析
图4. miRNA-mRNA调控网络和与circRNA相关的ceRNA网络
为了构建与circRNA相关的ceRNA网络，作者首先对负调控的miRNA-mRNA对进行了筛选和可视化，接着构建了具有24个下调的miRNA和158个上调的mRNA的网络（图4A）。不仅如此，作者还生成了另一个具有17个上调的miRNA和86个下调的mRNA的网络（图4B）。紧接着，作者又使用starBase预测了miRNA与circRNA之间的相互作用，并构建了一个ceRNA网络（图4C）。
4、TCGA数据库和real-time PCR验证
图5.代表性的RNAs表达验证
为了验证该发现，作者将ceRNA网络中的RNA表达水平与TCGA数据库进行比较，并通过real-time PCR进行验证。作者发现六个下调的mRNA和两个上调的miRNA的表达模式与TCGA数据一致（图5A-5H）。接着，作者又通过real-time PCR在结肠腺瘤和癌组织中验证了另外10个差异表达的RNAs（图5I和5J），发现RNA测序和real-time PCR结果一致。
5、ROC曲线分析
图6.三种circRNA的ROC曲线分析
作者通过real-time PCR验证了三个circRNA（hsa_circ_0049487，hsa_circ_0066875和hsa_circ_0007444）在ceRNA网络中的表达水平。作者通过文献检索发现ceRNA网络中与circRNA相关的miRNA和mRNA可能在癌症进展中起作用，这一发现提示了作者上述三种circRNA在癌症中可能存在潜在的作用。因此，作者采用ROC曲线分析来评估候选circRNA在结肠腺瘤和CRC中的诊断价值。结果如图6A-6B所示。该结果表明，上述三种circRNA在结肠腺瘤和癌症中有着良好的诊断价值，因此可以作为预测CRC的早期生物标志物。
小结
本文中，作者通过全面的RNA测序获得了邻近正常组织，结肠腺瘤和CRC组织的circRNA，miRNA和mRNA表达谱，紧接着又通过关注在结肠腺瘤和CRC中通常发生变化的RNA来确定几种候选物。但是，作者的研究也存在一些缺陷。首先，作者的数据基于RNA测序表达谱，还需要明确cirRNA相关的ceRNA的潜在功能和机制。其次，这项研究的临床样本数量有限，需要更大规模的验证来验证这些发现。总而言之，作者的发现阐明了从恶变前腺瘤向癌症转变的机制，鉴定了与circRNA相关的特定信号。这可能提供一个新颖的观点，并可能用于CRC的早期诊断和潜在的治疗靶点。