糖尿病大血管病变发病机制——氧化应激
作者：上海交通大学附属第六人民医院 陈明云 李连喜
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氧化应激(oxidative stress)是指促氧化和抗氧化平衡失调，导致氧化作用增强的一种氧化还原状态。线粒体氧化磷酸化过程中消耗的氧约有0.4%~4% 转化为超氧自由基，后者通过一系列反应产生其他活性氧(ROS)。除线粒体途径外，细胞内其他氧化酶系(主要是NADH /NAPDH氧化酶)也可产生ROS。正常时机体内ROS的产生和清除之间存在着一个动态平衡，但在各种病理状态如高血糖时，机体ROS产生增多和/或ROS清除减少便产生氧化应激。
糖尿病大血管病变的氧化应激相关酶
血管壁中存在各种活性氧产物，产生于NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）氧化酶、黄嘌呤氧化酶、线粒体呼吸链以及解偶联的内皮NO合成酶等。糖尿病大血管病变时氧化应激增强，是促氧化和抗氧化的平衡失调，而参与这过程的酶有主要有以下几种。
NADPH氧化酶
NADPH氧化酶表达广泛，不仅在浸润的单核细胞/巨噬细胞中表达，在血管壁细胞中也可检测到。NAPDH氧化酶是多亚基酶复合物，由2个膜结合亚单位（p22phox和一个Nox同系物）以及几个胞质调节亚基组成，使用NADPH作为电子供体，将分子氧转化为超氧化物。
研究发现小鼠体内存在多种Nox亚型，在小鼠血管平滑肌细胞中表达的是Nox1和Nox4两种亚型，内皮细胞则主要是Nox2和Nox4两种亚型。研究发现，不同的Nox亚型在动脉粥样硬化形成中发挥的作用并不相同。在糖尿病状态下，体内Nox1表达水平显著增加。Nox1基因敲除及载脂蛋白E（ApoE-/-）基因敲除小鼠在高脂饮食诱导及链佐星（streptozocin，STZ）诱导下，动脉粥样硬化斑块形成显著减少，提示Nox1可能在糖尿病大血管病变发病中发挥重要作用。Nox2同样也参与了糖尿病大血管病变的形成。Nox2基因敲除小鼠中降主动脉中的动脉粥样硬化形成显著减少。p47phx作为激活Nox1和Nox2两个亚单位所需的调节亚单位，与Nox1和Nox2的致动脉粥样硬化作用相一致，p47phx基因敲除小鼠动脉粥样斑块形成减少。与Nox1和Nox2致动脉粥样硬化作用相反，多项研究发现Nox4在小鼠体内介导抗动脉粥样硬化的作用。
Nox4介导的抗动脉粥样硬化的作用可能依赖于以下几种机制：（1）Nox4酶诱导超氧化物发生歧化，生成并释放过氧化氢；（2）Nox4不会导致过氧亚硝酸盐生成，因为Nox4生成的过氧化氢不与NO发生反应；（3）血管发生应激时，由Nox4生成的过氧化氢维持eNOS和血红素加氧酶-1的表达恒定；（4）Nox4生成的过氧化氢抑制血管平滑肌细胞增殖并防止血管炎症反应和血管重塑。
另外一个Nox亚型Nox5在啮齿动物中并不表达，但在人动脉粥样硬化斑块中的表达水平显著升高，具体机制目前还不明确。Nox介导的致动脉粥样硬化及抗动脉粥样硬化的作用并不是绝对的，与其他活性氧自由基一样，Nox催化生成的过氧化氢可能既具有保护作用，同时也可能具有损伤作用，这取决于过氧化氢的浓度、表达Nox的细胞类型及其亚细胞定位等。
研究还发现，在动脉粥样硬化发生过程中，单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞内Nox酶的存在是必需的。ApoE-/-和p47phox-/-基因敲除小鼠实验表明，单核细胞/巨噬细胞中的NADPH氧化酶活性对于低密度脂蛋白（LDL）的氧化是必需的。在血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中NADPH氧化酶催化生成的ROS参与了血管内皮细胞的激活（黏附分子的表达，单核细胞/巨噬细胞的浸润）和血管平滑肌细胞的增殖。
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤氧化酶（XO）将分子氧作为电子受体而产生超氧化物和过氧化氢。内皮细胞中的XO可被血管紧张素II和血流切变力等促动脉粥样硬化因素激活。另外，XO可以从肝脏释放出来，进入血液循环，进而与血管内皮细胞表面的糖胺聚糖结合而黏附在内皮细胞上。人体及动物研究都证实，动脉粥样硬化斑块模型中，血管内皮细胞中的XO和血液中的XO活性显著增强，提示XO衍生的超氧化物可能具有促动脉粥样硬化作用。使用XO抑制剂如别嘌呤醇、钨和非布索坦等可改善内皮依赖性的NO介导的血管舒张作用，减轻内皮功能障碍，抑制ApoE-/-基因敲除小鼠动脉粥样硬化的发展进程。然而，XO在动脉粥样硬化中作用的机制目前尚未彻底明确，有待进一步研究。
线粒体呼吸链
正常生理状态下，线粒体氧化磷酸化过程产生的超氧化物通过锰超氧化物歧化酶（MnSOD）转化为过氧化氢，随后由谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione peroxidase 1，GPx1）转化生成水。然而病理状态下，线粒体氧化应激平衡则可能被打破，ROS生成过多或ROS降解减少。考虑到ROS在动脉粥样硬化病变中的重要作用，因此线粒体氧化应激反应失衡与糖尿病大血管病变密切相关。
未耦合的eNOS
在生理条件下，血管内皮细胞的一氧化氮合酶（eNOS）催化生成NO，进而舒张血管，起到保护血管内皮细胞功能的作用。在氧化应激病理状况下，eNOS可能功能失调。氧化应激导致血管内皮功能障碍，主要是因为过量的过氧化物对NO的快速氧化反应而致NO失活。继而，持续的氧化应激反应导致eNOS脱耦合，使得其以消耗NO的代价产生超氧化物。机制上，过氧亚硝酸盐和超氧化物可以氧化四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）导致eNOS辅因子BH4缺乏。BH4缺乏、eNOS底物1-精氨酸缺乏以及eNOS发生谷胱甘肽化修饰可能是导致eNOS解偶联的主要原因。
环氧合酶
尽管有研究发现环氧合酶（Cyclooxygenase）可以间接调节血管ROS的产生，但并不能证明环氧合酶本身就是致病性ROS的来源。在动物水平研究中发现，环氧合酶-1抑制或缺失可减轻小鼠动脉粥样硬化病变程度。环氧合酶-2在小鼠体内发挥的作用则较为复杂，取决于特异性敲除的细胞类型。研究发现巨噬细胞中的环氧合酶-2可促进动脉粥样硬化发展，而特异性敲除小鼠巨噬细胞中的环氧化酶-2则可抑制动脉粥样硬化病变。T细胞中的环氧合酶-2同样具有轻微的促动脉粥样硬化作用。然而在血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中的环氧合酶-2似乎具有抗动脉粥样硬化的作用，其抗动脉粥样硬化作用机制可能依赖于前列环素的生物合成，另外也有研究提出了非前列环素依赖机制也部分参与了环氧化酶-2的抗动脉粥样硬化作用。
超氧化物歧化酶
哺乳动物组织中有3种超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）同工酶：（1）SOD1（铜/锌-SOD），位于细胞质中和线粒体膜间隙；（2）SOD2，主要定位于线粒体基质中；（3）SOD3（细胞外SOD），主要在细胞外基质、细胞表面和细胞外液中表达。所有3种同工酶通过催化分解超氧化物生成氧气和过氧化氢而发挥抗氧化作用。
与传统观点相悖，研究发现过表达SOD1的转基因小鼠比对照组小鼠发生更明显的动脉粥样硬化病变，提示SOD1对动脉粥样硬化的影响可能是剂量依赖性的。适量SOD1表达上调可减轻氧化应激，而过量的SOD1表达则可以通过增加下游氧化产物的形成加剧氧化应激损伤。SOD1过表达产生大量氢过氧化物，后者可生成致动脉粥样硬化分子如羟基自由基等。
SOD2是阻止线粒体电子传递链生成的超氧化物的第一道防线。研究发现SOD2缺乏（SOD2 /-）导致线粒体功能障碍，线粒体DNA损伤增加，加速ApoE-/-基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变过程。
SOD3在血管壁中大量表达。然而研究发现，给予SOD3缺失的ApoE-/-基因敲除小鼠高脂饮食1个月，小鼠动脉粥样硬化程度可得到轻微改善，高脂喂养3个月或者普食喂养8个月，实验组小鼠和对照组小鼠动脉粥样硬化病变没有显著差异。因此SOD3在动脉粥样硬化形成中的作用尚不清楚，有待进一步研究明确。
因此，SOD在动脉粥样硬化中的作用可能具有双面性。一方面，SOD可能通过抑制超氧化物引起的氧化应激损伤和NO的失活从而发挥抗动脉粥样硬化作用。另一方面，SOD也可能由于下游氧化应激相关酶（例如过氧化氢酶和GPx等）的活性不足而致清除SOD反应产物减少，从而加重氧化应激损伤。
过氧化氢酶
过氧化氢酶（Catalase）仅定位于过氧化物酶体中，可催化过氧化氢还原成氧和水。过氧化氢酶的过表达可以减轻ApoE-/-基因敲除小鼠的动脉粥样硬化病变。在高脂饮食的ApoE-/-基因敲除小鼠中，过氧化氢酶的过表达可降低动脉粥样硬化病变，而SOD1过表达则未见明显抗动脉粥样硬化作用。其潜在机制可能是超氧化物对高脂诱导ApoE-/-小鼠发生动脉粥样硬化的作用较小，这些致动脉粥样硬化因素刺激（例如氧化型低密度脂蛋白，oxLDL）主要产生的是过氧化物而不是超氧化物。
谷胱甘肽过氧化物酶
谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidases，GPx）是广泛存在于细胞中的抗氧化酶，可将过氧化氢还原为水和脂质氢过氧化物还原为相应的醇。GPx1属于GPx家族，在线粒体和细胞质中都有广泛表达。研究发现红细胞中GPx1的活性降低和冠状动脉疾病患者的心血管事件风险增加相关。
GPx1不足还可促进LDL氧化、泡沫细胞形成和巨噬细胞增殖。研究还发现GPx1的缺乏可加剧ApoE-/-基因敲除小鼠的动脉粥样硬化病变。以上研究表明GPx1对动脉粥样硬化具有保护作用。GPx4具有类似的抗动脉粥样硬化作用，尽管该GPx酶与其他GPx家族成员在结构、细胞内定位和功能特征上有所不同。GPx4降低氢过氧化物和各种脂质氢过氧化物，包括氧化磷脂和胆固醇氢过氧化物。GPx4通过预防脂质过氧化和血管细胞氧化脂质来减轻ApoE-/-基因敲除小鼠的动脉粥样硬化病变。
对氧磷酶
对氧磷酶（Paraoxonase）家族主要有3个成员：对氧磷酶1、对氧磷酶2和对氧磷酶3。对氧磷酶具有重叠和不连续的酯酶和内酯酶活性，可代谢/水解花生四烯酸氧化产物（所有3种对氧磷酶）、有机磷酸盐（对氧磷酶1）和药物（例如洛伐他汀和螺内酯，通过对氧磷酶3）。这3种对氧磷酶蛋白皆可降低氧化应激反应、降低脂质过氧化，从而减轻动脉粥样硬化病变，但机制并不相同。
对氧磷酶1主要由肝脏合成，并与高密度脂蛋白（HDL）颗粒结合。HDL的抗动脉粥样硬化特性部分归因于对氧磷酶1的酯酶、过氧化物酶样和磷脂酶样活性。HDL相关的对氧磷酶1可抑制氧化磷脂的形成和低密度脂蛋白（LDL）的氧化，因此，对氧磷酶1的过表达可减轻动脉粥样硬化，而对氧磷酶1基因的破坏则加重动脉粥样硬化。对氧磷酶2在血管壁中大量表达，但在血浆中无法检测到。对氧磷酶2位于细胞内结构如内质网或线粒体，可减少超氧化物形成和抑制ER应激信号。并且对氧磷酶2可以因氧化应激反应而转移到质膜中，抑制脂质过氧化并调节葡萄糖神经酰胺的含量。动物实验证实对氧磷酶2可预防LDL过氧化，降低血管细胞的氧化应激反应，从而减轻动脉粥样硬化病变。在人组织中研究发现，动脉粥样硬化斑块中对氧磷酶2的表达水平显著低于斑块相邻组织，提示对氧磷酶2可抑制动脉粥样硬化病变发展。对氧磷酶3在血清和细胞中都可检测到，与对氧磷酶1一样，可防止LDL氧化。与对氧磷酶2相似，对氧磷酶3通过与辅酶Q10（泛醌）的相互作用可以预防线粒体超氧化物形成从而发挥抗氧化应激作用。在Q循环（辅酶Q在传递电子的同时泵出质子，形成一个循环过程称为Q循环）期间，不稳定的中间体泛半醌可以向分子氧提供电子，产生超氧化物。对氧磷酶2和对氧磷酶3存在于线粒体内膜中，并以高亲和力结合辅酶Q10，对氧磷酶2与泛半醌螯合从而减少线粒体超氧化物形成。
硫氧还蛋白
硫氧还蛋白（Thioredoxin）系统涉及硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和硫氧还蛋白过氧化物酶。硫氧还蛋白可以通过半胱氨酸硫基-二硫键交换来还原靶蛋白。硫氧还蛋白过氧化物酶也可以直接清除过氧化氢，而硫氧还蛋白还原酶可将氧化的硫氧还蛋白转化为还原形式以保持其氧化还原活性。研究发现血管内皮细胞硫氧还蛋白还原酶2（TrxR2）的特异性缺失导致血管僵硬增加、内皮功能受损和血栓形成，促进血管炎症反应发生。相反，血管内皮细胞线粒体硫氧还蛋白的特异性过表达则改善内皮细胞功能并减轻ApoE-/-基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变程度。
氧化应激途径在糖尿病周围大血管病变中的作用及机制
正是以上几种抗氧化或促氧化酶之间的相互作用，维持了机体氧化还原反应之间的平衡。而在糖尿病患者中，高血糖通过多种途径导致细胞内ROS生成过多、清除不足，从而增强了机体的氧化应激水平，高血糖引发氧化应激的机制包括几个方面：
首先，高血糖通过加重线粒体负荷而直接增加ROS的产生。细胞内高浓度葡萄糖的存在使得过多的葡萄糖经糖酵解代谢途径生成丙酮酸，后者在线粒体中经三羧酸循环提供过多的供氢体(NADH和FADH2)给线粒体呼吸链，从而产生过多的ROS而引发氧化应激。同时，在有氧环境中，葡萄糖可以自氧化产生ROS如羟基，故细胞内葡萄糖增高导致葡萄糖自氧化作用增强而引起氧化应激。
第二，高血糖时机体蛋白非酶催化的糖基化作用增强，因此抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)等的糖基化必然导致其酶活性改变，对自由基的清除能力下降。高血糖也可使抗氧化剂如维生素E等水平降低，使机体对自由基的清除能力下降。
第三，高血糖时多元醇代谢途径活化，消耗大量的NADPH，导致GSH再生减少和NO合酶活性减低，从而诱导ROS合成，同时，由于NADH的增加，使得其被NAD(P)H氧化酶利用增加从而产生超氧化物，NADH本身也可使线粒体中ROS产生增加。
第四，高血糖时DAG-PKC信号通路的激活使ROS生成进一步增加，而ROS 也可活化PKC信号通路，使得ROS生成进一步增加，形成一种恶性循环。
第五，AGE-RAGE的相互作用也可诱导ROS的产生，可能是通过NAD(P)H 氧化酶而实现的。
第六，高血糖能够直接诱导血管平滑肌细胞内血管紧张素的产生，而血管紧张素Ⅱ可通过激活NADPH/NADH系统导致超氧离子的产生，引起氧化应激。
氧化应激在糖尿病大血管病变中的作用及机制主要包括以下几个方面：
第一，导致血管内皮细胞功能失调。正常生理条件下，内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase, eNOS)生成的NO在调节血管内皮细胞张力、 扩张血管、调节血压、抑制血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖等功能中起重要作用，但是糖尿病状态下脱偶联的eNOS不再生成NO而是产生超氧阴离子，造成NO生物利用度降低及氧化应激增加，进而导致或加重内皮功能障碍。
第二，氧化LDL脂蛋白。现在一般认为，氧化应激时由于氧化环境的存在，使得LDL更加易于被氧化，ox-LDL一方面通过磷脂酶A2信号途径激活NADPH氧化酶在血管内皮细胞内产生氧化应激，同时ox-LDL作用的增强也可以通过其受体LOX-1的上调而实现， 而ox-LDL促动脉粥样硬化作用更强。
第三，促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移。血管平滑肌细胞的增殖和迁移在AS的发病中起重要作用，已经有研究证实，高血糖可以通过激活NAD(P)H氧化酶而增加血管平滑肌细胞内的超氧离子，增加的ROS可能与内皮细胞来源的NO发生反应从而抑制了NO对血管平滑肌细胞的舒张效应，同时血管平滑肌细胞内的氧化应激可能促使血管平滑肌细胞从收缩型向增殖型转变，从而进一步抑制了血管的舒张，加重血管损害的发生。
最后，氧化应激可以激活单核/巨噬细胞。已经有证据提示高血糖可以引起单核/巨噬细胞内的氧化应激反应增强，从而导致致AS物质的产生，激活的单核/巨噬细胞可以释放多种细胞因子而促进动脉粥样硬化斑块的进展，同时，激活的单核细胞浸润进入血管壁转变为巨噬细胞，后者清除修饰的脂蛋白而转变为泡沫细胞，这些细胞可以分泌多种炎症介质并产生ROS，从而引起并加重糖尿病血管炎症反应。