易基因 | 新研究：ChIP-seq揭示酒精性肝炎超级增强子调控机制
2021年7月27日，美国明尼苏达州罗彻斯特梅奥诊所Hui Huang Yan和Vijay H. Shah团队在Nature Communications上发表了题为“Super enhancer regulation of cytokine-induced chemokine production in alcoholic hepatitis”的研究论文，该研究通过ChIP-Seq技术揭示了肝窦内皮细胞（LSEC）和浸润性免疫细胞是酒精性肝炎（AH）中CXCL趋化因子的主要来源，受TNFα/NF-κB 信号调控，并证实了超级增强子的存在，为AH的预防和治疗提供了更精确的方向。
技术亮点：ChIP-Seq
染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。
不同组蛋白的差异性修饰与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用某一特定组蛋白修饰的特异性抗体富集与带修饰组蛋白相结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种特定组蛋白修饰类型与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。
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标题：Super enhancer regulation of cytokine-induced chemokine production in alcoholic hepatitis（超级增强子在酒精性肝炎中调控细胞因子诱导的趋化因子生成）
发表时间：2021年7月27日
期刊：Nature Communications
影响因子：14.919
技术方法：ChIP-Seq、RNA-seq
研究背景：
酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）是指过量饮酒所致的一种肝脏疾病，严重的AH可导致急性或慢性肝功能衰竭。若不积极治疗，30天死亡率超过30%。炎症是AH发病的主要驱动因素，许多细胞因子和趋化因子在AH中高度上调，TNFα就是其中之一。然而，TNFα信号如何导致AH下游转录调控机制尚不清楚。此外，增强子调控TNFα介导的炎症响应机制在许多炎症发生过程中得到证实，但AH中组蛋白修饰和远距离顺式调控元件在TNFα介导的转录调控作用还没有相关研究报道。
研究结果：
（1）RNA-seq和ChIP-seq 显示AH和正常肝脏中的差异基因表达和组蛋白修饰模式
对重度AH患者肝脏组织（n=6）和正常肝脏组织（n=4）进行RNA-seq和多种组蛋白修饰的ChIP-seq，将组蛋白修饰的差异分布结果和差异表达基因相结合，确定可能受表观遗传调控的候选基因：与启动子相关的H3K4me3，与增强子相关的 H3K4me1 和 H3K27ac，与Polycomb抑制相关的H3K27me3（图1a）。分析显示AH患者肝脏中396/950个上调基因和512/761个下调基因显示出明显的组蛋白修饰差异（图1b）。作者利用Ingenuity pathway analysis（IPA）软件对差异基因进行功能分析，确定了与AH中差异表达和组蛋白修饰图谱相关的信号通路富集（图1c）。几个 CXCL 趋化因子位于4号染色体上的同一基因位点附近，并在AH患者中表达显著上调（图1d）。上游的调控因子分析显示TNFα、TGFβ、IL1β 等多种通路基因参与驱动AH中基因表达重编程的调控，SMARCA4 和 SP1等多种表观遗传修饰相关基因在AH 中被激活（图1e）。GSEA富集分析显示TNFα 和NF-κB 通路基因在AH中呈现选择性上调的趋势。
图1
（2）肝窦内皮细胞（LSEC）是 AH 中 CXCL 趋化因子的主要来源，受TNFα/NF-κB 信号调控
通过FANTOM5人类基因表达谱数据库和对人类肝细胞类型的RNA-seq数据分析，均证实LSEC是CXCL 产生趋化因子1、6、8的主要细胞类型（图2a）。LSECs是肝脏内一类庞大的细胞系群，而TNFα是一种是差异表达的关键上游调控基因，研究人员将LSEC 在体外暴露于 TNFα信号后，qPCR显示 CXCL 趋化因子基因表达显著增加（图 2b）。此外，为了测试LSECs中NF-κB信号传导的重要性，将Celastrol（一种阻断NF-κB转运至细胞核的蛋白酶体抑制剂）对LSECs进行预处理，qPCR显示CXCL趋化因子表达显著降低，且对TNFα信号的刺激作用以剂量依赖性方式降低（图2c）。
这种趋化效应在LSECs的TNFα预处理中进一步增强，而在Celastrol预处理中降低，说明在体内观察到的CXCL差异表达具有生物学相关性。也进一步证实了LSEC是AH中CXCL趋化因子的主要来源，且受TNFα/NF-κB 信号调控。
图2
（3）超级增强子诱导的多种CXCL趋化因子基因表达依赖于NF-κB
增强子-启动子相互作用在基因转录调控中起重要作用，为确定超级增强子的存在，研究人员多方位实验、反复验证。通过对环状染色体构象捕获测序（4C-Seq）发现识别（图3a，b），对HUVEC 细胞系中的NF-κB(RELA subunit) 、LSEC细胞系中的NF-κB (RELA/p65) 进行ChIP-seq分析，将转录调控因子BRD4 和 HUVEC/LSEC细胞系 ChIP-seq强富集区域结合（图3c），超级增强子的排序算法(ROSE) （图 3d、e），使用染色体构象捕获（3C）实验（图 3f）。结果证实了超级增强子的存在，超级增强子可诱导多个CXCL 趋化因子（1,2,3,6,8）基因表达，且依赖于NF-κB信号。
图3
（4）CXCL 超级增强子和CXCL1启动子位点的表观遗传抑制调控趋化因子基因表达
为确定CXCL超级增强子和 CXCL 启动子位点的组蛋白修饰调控趋化因子基因表达情况，研究人员对LSEC超级增强子区域进行靶向dCas9-KRAB融合蛋白抑制处理（图 4a），发现dCas9-KRAB抑制因子显著降低了多种CXCL基因表达，而附近非炎症基因MTHFD2L表达则没有变化（图 4b），针对CXCL1启动子中预测的NF-κB 结合位点进行位点特异性基因抑制处理，结果同样表明CXCL1表达受到抑制，而其他CXCL基因和附近的非炎症基因不受影响（图 4c）。对KRAB介导的主要表观遗传学沉默基因 H3K9me3进行富集分析，结果发现通过dCas9-KRAB介导的表观基因组编辑，在超级增强子和CXCL1启动子区域中靶向 NF-κB 结合位点的H3K9me3占有率增加（图 4d））。
图4
（5）BET 抑制剂通过抑制AH小鼠模型中的CXCL基因表达来减少肝脏中性粒细胞浸润
为检测以上研究发现的生物学相关性，研究人员以小鼠为模型，验证小鼠模型体内超级增强子表观遗传学抑制的效果。小鼠体内数据结果表明，BET 抑制剂iBET151会抑制肝脏CXCL基因表达，抑制超级增强子活性，从而降低AH小鼠模型的炎性反应，与此前体外 LSEC 研究结果一致（图5）。也证实了BET 抑制剂UMN627可以通过抑制CXCL基因表达来充分减少酒精/LPS注射诱导的肝脏炎性反应（图6）。
图5
图6
易基因小结
在这项研究中，首先研究了AH炎症信号的转录调控，旨在阐明肝脏炎症信号从免疫细胞浸润到肝脏组织的过程。得出以下结论：
（1）人体酒精性肝炎（AH） 肝脏组织转录组和表观组学均发生很大变化，几种 CXCL 趋化因子显著上调；
（2）肝窦内皮细胞（LSEC）和浸润性免疫细胞是AH 中CXCL趋化因子的主要来源，受TNFα/NF-κB 信号调控；
（3）存在CXCL趋化因子的超级增强子，诱导多个CXCL 趋化因子（1,2,3,6,8）基因表达，且依赖于NF-κB信号；
（4）CRISPR dCas9-KRAB 或 BET抑制剂可抑制超级增强子，从而抑制CXCL基因表达；
（5）BET抑制剂通过抑制AH小鼠模型中的CXCL基因表达来减少肝脏中性粒细胞浸润。
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