二甲双胍促进成骨细胞/破骨细胞分化与缺血性骨坏死相关性研究
原文作者：Jung Ryul Kim, Kyu Yun Jang;作者单位：韩国全北国立大学医学院骨科、全北国立大学临床医学研究所、全北国立大学医院生物医学研究所和内分泌科学研究所
梁大伟 主治医师
新乡医学院（本科）
昆明医科大学（研究生）
中国中医药研究促进会骨坏死专业委员会委员
中国冲击波医学专业委员会骨循环与骨坏死专家委员会委员
在本研究中，我们旨在确定一种候选药物，通过药物重新定位激活内源性血管生成素1 (Ang1)的表达来治疗缺血性骨坏死。从食品和药物管理局821种药（FDA）批准的药品库遴选后，通过ELISA检查U2OS细胞培养基中的Ang1表达。二甲双胍作为治疗2型糖尿病的一线药物，被选择作为体外和体内实验评估的候选药物。在U2OS和MG63细胞中，通过二甲双胍处理，Ang1被诱导并且碱性磷酸酶活性增加。伤口愈合和迁移分析显示，在U2OS和MG63细胞中，通过二甲双胍治疗可增加成骨细胞的移动性。二甲双胍上调了U2OS和MG63细胞成骨细胞分化蛋白标志物的表达，但抑制了Raw264.7细胞的破骨细胞分化。二甲双胍(25 mg/kg)对大鼠股骨头骨骺缺血性坏死具有保护作用，维持坏死股骨头的成骨细胞/骨细胞功能和血管密度，抑制破骨细胞活性。这些发现提供了对二甲双胍在成骨细胞分化中靶向和调节的特定生物标志物的新见解，并有助于理解这些FDA批准的小分子药物作为缺血性骨坏死的新疗法的作用。
股骨头缺血性坏死(INFH)可导致永久性股骨头畸形，严重影响髋关节寿命，在30岁时可能出现过早的晚期骨关节炎。目前正在研究使用生物制剂来保护股骨头并避免关节置换手术。就预防缺血性骨坏死后股骨头畸形的发展而言，血管生成和继发性成骨的治疗概念已引起了相当多的关注[1]。到目前为止，已有多种生长因子被报道调控血管生成[2]。其中，血管生成素1 (Angiopoietin 1, Ang1)是众所周知的血管生成因子，在骨形成新血管的刺激和发展中发挥关键作用[3,4]。之前，我们报道了Ang1的嵌合形式重组COMP-Ang1蛋白通过增强血管生成促进坏死股骨头修复[5]。开发新药既昂贵又费时[6]。最近，人们提出了“药物重新定位或重新利用”的新概念来寻找和开发新的药物[7]。这种方法通过阐明新的活性和靶分子，将临床使用的药物应用于其他特定疾病[8]。这具有许多优点，例如无需测试毒性或评估药代动力学[9]。这些优势可以大大降低开发新药的成本和时间，从而提高成功率[10]。在这项研究中，我们采用了药物重新定位的概念来确定候选药物，以通过诱导Ang1表达来促进成骨细胞样细胞的分化。在通过ELISA筛选FDA批准的药物库后，我们选择了二甲双胍作为此类候选药物。二甲双胍目前被用作治疗2型糖尿病的主要药物[11]，特别是对于肾功能正常的超重或肥胖患者[12]。二甲双胍通过激活肝脏中的AMP活化蛋白激酶（AMPK）[14]来提高血糖水平[13]，从而抑制脂肪酸的生物合成[15]，促进葡萄糖吸收进入细胞[16]并抑制代谢综合征[17] 。在这项研究中，我们证明了二甲双胍在体外细胞模型中诱导成骨细胞分化并抑制破骨细胞分化。此外，二甲双胍在体内INFH大鼠模型中通过诱导血管生成来防止股骨头畸形。我们的结果为通过药物重新定位治疗INFH提供了有效的治疗策略。二甲双胍增加U2OS和MG63细胞中的
Ang1表达和细胞迁移
用821种FDA批准的药物处理后，通过ELISA在U2OS细胞中检测了Ang1表达[18]（图1A和表1），二甲双胍被选为最强的候选药物之一。如图1B所示，二甲双胍增加了U2OS和MG63细胞中Ang1的表达。在二甲双胍治疗组中，Ang1蛋白在两种细胞类型中的表达水平均呈剂量依赖性上调。为了证实Ang1表达是由U2OS和MG63细胞中的二甲双胍处理诱导的，浓缩总蛋白并通过Western印迹分析来自用或不用二甲双胍处理的U2OS和MG63细胞的细胞培养基。与DMSO载体对照相比，5μM二甲双胍显着增加了U2OS和MG63细胞中Ang1的表达。尽管二甲双胍增加了Ang1的表达，但血管生成素2的表达没有差异，这表明二甲双胍对Ang1的表达具有特异性（图1C）。由于二甲双胍在U2OS和MG63细胞中促血管生成的Ang1表达增强，因此我们测试了二甲双胍是否会影响U2OS和MG63的细胞迁移（血管生成结果）。如图1D所示，二甲双胍剂量依赖性地增加了横穿膜的U2OS和MG63细胞。此外，伤口愈合测定结果显示在U2OS和MG63细胞中用二甲双胍治疗后伤口闭合显著加速（图1E）。
二甲双胍可加速成骨细胞矿化并上调
U2OS和MG63细胞中的成骨细胞分化
如图2A所示，二甲双胍处理的U2OS和MG63细胞（2.5、5和10μM）中的ALP活性显着高于DMSO处理的细胞。成骨细胞矿化是指沉积大量的细胞外钙，这被认为对骨形成至关重要[19]。二甲双胍治疗20天以剂量依赖性方式增加茜素红S染色的U2OS和MG63细胞（图2B）。茜素红S染色的定量表明，与DMSO处理相比，5uM二甲双胍治疗后染色显着增加（图2C）。这些结果表明二甲双胍可增强体外成骨细胞的分化和矿化。 如图2D所示，与DMSO载体对照相比，5μM二甲双胍显着增加了U2OS和MG63细胞中的COL1A1，OC，BSP，Dlx5，Runx2和OSX表达。而且，ALP表达水平显着，与ALP活性的变化一致。
据报道，在成骨细胞分化过程中，p38 MAPK与Runx2 [20]和OSX [21]发生物理相互作用并转录激活。因此，我们检查了二甲双胍是否可以在U2OS和MG63细胞中诱导p38 MAPK的磷酸化（激活）。如图3A所示，二甲双胍以剂量依赖性方式增加了p38 MAPK（p-p38 MAPK）的磷酸化形式。然后，我们研究了二甲双胍治疗U2OS和MG63细胞后p38 MAPK与Runx2或OSX之间的蛋白质相互作用。如图3B所示，二甲双胍在U2OS和MG63细胞中提高了p-p38 MAPK表达，并且与Runx2或OSX相互作用的p38 MAPK蛋白的量增加了。这些结果表明，二甲双胍通过激活p38 MAPK来上调Runx2和OSX蛋白的转录活性，从而导致其他蛋白（如COL1A1，OC，BSP和Dlx5）的高表达来促进成骨细胞分化。
如图4A中所示，与DMSO对照相比，二甲双胍在RAW264.7细胞中降低了IL-6表达。接下来，我们更详细地研究了二甲双胍对RAW264.7细胞中IL-6表达的控制。为此，我们进行了IL-6，p-Iκbα，Iκbα，IKKβ和NFκBp65的蛋白质印迹。NFκBp65是一种众所周知的转录因子，可调节破骨细胞中IL-6的表达。如图4B所示，二甲双胍可下调IL-6，p-Iκbα，IKKβ和NFκBp65，而Iκbα则保持不变。这些结果暗示通过抑制IKKβ降低了NFκBp65的转录活性，从而导致IL-6表达的降低。此外，如图4B所示，二甲双胍在RAW264.7细胞中降低了c-Src，TRAP和组织蛋白酶K（破骨细胞分化的知名蛋白质标志物）的表达水平。就防止RAW264.7细胞分化为破骨细胞而言，这与上述IL-6表达结果一致。为了测量TRAP阳性多核RAW264.7细胞，将细胞与重组RANKL和二甲双胍温育2或7天。如图4C和4D所示，二甲双胍以剂量依赖的方式减少了TRAP阳性多核细胞，这一点已由TRAP活性测定法证实（图4E）。
尽管二甲双胍注射组和对照组的体重或一般状况无显着差异，但在手术诱发的股骨头缺血性坏死（INFH）对照组中观察到股骨头骨骺部分吸收（图5A）。然而，注射INFH二甲双胍的组显示出完整的股骨头骨骺，与假手术组相似（图5A）。μCT分析显示，与假手术组划分，INFH的单位组织体积和小梁多个的骨量减少，总增量率增加（图5B）。另一方面，与INFH对照组相比，二甲双胍组的INFH中单位组织体积的骨体积和小梁数量明显增加。而且，二甲双胍组的INFH中的小梁分离和总孔隙率显着降低（图5B）。H＆E染色和番红O染色显示在INFH对照中破坏了股骨头的软骨并聚集了炎性细胞。但是，二甲双胍组在INFH中股骨头是完整的（图5C）。这些结果表明，注射二甲双胍对大鼠手术引起的INFH具有保护作用。
二甲双胍维持成骨细胞/骨细胞功能和血管密度，
但抑制骺骨中的破骨细胞活性
为了确定二甲双胍对INFH保护作用的基础，我们在股骨头石蜡切片中进行了免疫组织化学染色。在INFH对照中，前成骨细胞标志物ALPL和成熟成骨细胞标志物DMP1的表达降低（图6A）。但是，二甲双胍组的INFH与假手术组的ALPL和DMP1表达相似。为了评估二甲双胍对股骨头血管的作用，对股骨头进行了vWF免疫染色，vWF是血管内皮细胞的标志物。对vWF抗原的免疫染色显示，与INFH对照相比，二甲双胍在INFH中的血管更多（图6A）。同样，与INFH对照相比，二甲双胍组的INFH中的血管密度显着增加（图6B）。这些结果表明二甲双胍在由维持成骨细胞功能和血管密度引起的INFH中具有保护作用。由于破骨细胞活性导致AVN中的骨破坏，我们使用TRAP染色评估了破骨细胞活性。在二甲双胍组中，TRAP阳性细胞在INFH对照中增加，但在INFH中减少（图6C）。尽管在癌症模型中有许多关于二甲双胍抗血管生成活性的研究[22-24]，但我们通过诱导成骨细胞中Ang1表达来促进二甲双胍的促血管生成作用。与我们发现的激活血管生成以克服股骨头缺血性疾病的观点相同，许多出版物描述了使用二甲双胍治疗脑缺血性疾病的类似方法[25-27]。缺血性中风是死亡和残疾的主要原因。 对于潜在的治疗策略，研究人员发现，长期服用二甲双胍可预防小鼠模型中的缺血性中风[28]。最近，Abdelsaid等人他们在糖尿病大鼠中诱发缺血性损伤，并用二甲双胍治疗。糖尿病大鼠中由缺血性损伤形成的过量过氧亚硝酸盐会导致中风后脑细胞凋亡，二甲双胍可防止这种硝化应激并恢复脑组织中的血管生成功能，如通过原代培养内皮细胞的伤口愈合和肾小管形成分析所评估的那样 大鼠细胞。研究表明二甲双胍具有恢复糖尿病大鼠模型脑血管生成的潜力[29]。因此，二甲双胍通过激活血管生成的药理作用和机制可能导致脑缺血中的神经保护作用。如图1D和1F所示，当将U2OS和MG63细胞与二甲双胍一起孵育时，我们观察到剂量和时间依赖性地增加了细胞迁移率。然而，仍不清楚由二甲双胍或二甲双胍本身诱导的Ang1是否直接影响细胞迁移。越来越多的证据表明，糖尿病患者面临更高的骨折风险。 尽管已经进行了几项观察性研究来研究这种关系，但仍未确定糖尿病导致骨折的主要危险因素[30-32]。最近一项针对七种临床使用的抗糖尿病药物对骨折的治疗效果的荟萃分析研究表明，噻唑烷二酮显着增加了老年女性的骨折风险，但二甲双胍似乎对糖尿病患者的骨折发生率没有影响[ 33]。二甲双胍是2型糖尿病的一线药物，已显示具有成骨分化潜能。最近的一项研究表明二甲双胍可促进间充质干细胞的成骨分化和矿化[34]。该研究表明，二甲双胍显着增强了ALP活性，矿化的结节形成以及Runx2和OSX的表达，这与我们在成骨细胞系中的数据（图2A–2C）一致。有趣的是，他们通过检查二甲双胍对LKB1 / AMPK信号传导途径的影响阐明了分子机制的细节，其中LKB1 / AMPK包含由二甲双胍激活的公认的靶蛋白。因此，为了扩大研究范围，我们测试了二甲双胍是否影响U2OS和MG63细胞中LKB1 / AMPK信号通路的激活。Xinyu等报道在高葡萄糖细胞培养基下，MG63成骨细胞的增殖率低于正常葡萄糖细胞培养基下，二甲双胍治疗挽救了这种抑制MG63细胞增殖的作用[35]。通过Western印迹和实时PCR分析，他们还表明二甲双胍可提高MG63细胞中COL1A1，OC和骨保护素（OPG）的表达，并具有增强的APL酶活性（图2D）。例如在人类间充质干细胞的成骨细胞分化过程中，p38 MAPK被磷酸化（激活）[36]。SB203580是p38 MAPK的药理抑制剂，可损害MC3T3细胞的成骨细胞分化并下调ALP，OC和COL1A1的表达[37，38]。作为在成骨细胞分化中激活p38 MAPK的体内证据，一些报道表明，p38 MAPK基因敲除的转基因小鼠损害了成骨细胞的分化，骨骼组成和维持能力[39，40]。如我们研究的结果部分所述（图3A和3B），二甲双胍处理使p38 MAPK磷酸化，显示出与Runx2 [20]和OSX [21]的更强结合，这似乎增加了它们在成骨细胞分化过程中的转录活性。Ge等根据萤光素酶分析法，p38 MAPK证明使用特定的磷酸化Runx2抗体使Runx2的Ser319磷酸化并激活Runx2的转录活性，从而导致成骨细胞分化[41]。在其他报道中，p38 MAPK通过募集p300和BRG-1磷酸化OSX的Ser33和Ser77，并激活OSX的转录活性[42，43]。如图3B所示，在U2OS和MG63细胞中，二甲双胍对p38 MAPK的磷酸化作用增强了p38 MAPK与Runx2或OSX之间的蛋白质相互作用，这可能表示Runx2和OSX调控与成骨细胞分化相关的其他基因的转录能力增强 COL1A1，OC，BSP和Dlx5。目前，我们正在尝试验证Runx2和OSX是否相互结合并相互协作以增加其蛋白质稳定性，并通过二甲双胍定位细胞核的转录活性。Artigas等报道显示，这种相互作用需要p38 MAPK的作用，Runx2和OSX的突变磷酸化位点阻止了它们的相互作用[44]。但是，尚不清楚二甲双胍诱导的Ang1或二甲双胍本身是通过Runx2和OSX的转录激活直接影响p38 MAPK的磷酸化。使用具有Ang1敲除或敲除作用的细胞系和小鼠模型可以解决此问题。考虑到p38 MAPK在骨骼发育中的关键作用的数量，我们集中于二甲双胍作为成骨作用的主要工作机制激活p38 MAPK。骨重塑是成骨细胞与破骨细胞分化之间平衡的结果。 因此，开发针对缺血性骨坏死的最佳疗法的策略可能针对成骨细胞的激活或破骨细胞的抑制。破骨细胞的分化受炎症因子和激素的调节[45]。在各种炎性因子中，IL-6已得到积极研究，并且已知与破骨细胞分化密切相关[46，47]。此外，IL-6可能刺激成骨细胞表达RANKL以增强破骨细胞分化[47]。因此，我们旨在研究二甲双胍处理在RAW264.7破骨细胞中IL-6的表达。如图4A和4B所示，当RAW264.7破骨细胞与二甲双胍一起温育时，IL-6的表达和分泌较少。该结果表明，二甲双胍通过下调IL-6抑制破骨细胞分化，这已被破骨细胞分化的其他蛋白质标记和TRAP分析所证实（图4）。尽管我们显示了NFκB/IKKβ信号通路参与了二甲双胍对RAW264.7细胞中IL-6表达的调节，但我们需要评估破骨细胞中IL-6控制的其他信号通路。根据最近的一项研究，IL-6可以激活Janus活化激酶（JAK），导致信号转导子和转录激活子3（STAT3）转录因子的磷酸化，这是负责RANKL表达的原因[48]。因此，我们正在研究二甲双胍对破骨细胞中IL-6 / JAK / STAT3 / RANKL通路的调控。Hye-Jin等证明在胶原诱导的关节炎（CIA）小鼠模型中，通过下调产生IL-17的T细胞（Th17）和上调调节性T细胞（Treg），二甲双胍具有抗关节炎活性[49]。据他们称，二甲双胍的给药抑制了CIA中的破骨细胞活性以及与破骨细胞分化相关的基因的表达，例如RANKL，TRAP，MMP-9，整联蛋白3，降钙素受体和组织蛋白酶K，这与我们的蛋白质印迹分析一致（图4B ）和CIA中的破骨细胞活性。这些结果表明二甲双胍是类风湿关节炎和缺血性骨坏死的潜在治疗选择。与对照相比，缺血性坏死手术后给予二甲双胍可维持成骨细胞/骨细胞功能和血管密度，并抑制破骨细胞活性。二甲双胍的这些作用在缺血性骨坏死中具有保护作用。我们的发现支持了其他各种体内模型的发现。 首先，在对照组和糖尿病大鼠中，均等开颅手术后，二甲双胍提高了由Runx2和AMPK激活介导的骨愈合[50]。此外，与WT小鼠相比，AMPK剔除小鼠的皮质和小梁骨质量更小[51]。其次，二甲双胍通过调节破骨细胞形成防止卵巢切除大鼠的骨质流失[52，53]。第三，与载体治疗的大鼠相比，二甲双胍诱导结扎诱导的牙周炎中牙槽骨损失的减少[54]。这些数据和我们的结果表明，二甲双胍对骨骼疾病具有有益的作用。但是，高浓度的二甲双胍（200 mg / kg /天）对牙周炎或骨折愈合引起的骨缺损没有影响[54，55]。Aurigena等提示低浓度的二甲双胍（50 mg / kg /天）可降低大鼠结扎诱发的牙周炎的炎症反应，氧化应激和骨质流失[54]。此外，极低剂量的二甲双胍（10 mg / kg /天）可通过增加成骨细胞的分化来预防由牙周炎引起的骨质流失[56]。因此，我们在INFH大鼠模型中使用了低剂量的二甲双胍（25 mg / kg /天）。总体而言，我们证明了二甲双胍可提高Ang1表达并在体外诱导U2OS和MG63细胞系中的骨形成、骨分化和骨矿化，并在体内增加缺血的股骨头中的血管形成和新骨形成（图5和6）。该研究通过提供对其在成骨细胞/破骨细胞分化过程中调节的特定生物标志物的新见解，揭示了二甲双胍的新方面。由于二甲双胍已经广泛用于糖尿病患者，因此这项研究有助于扩大缺血性骨坏死的治疗选择。提起二甲双胍，可追溯到20世纪20年代，是从一种名为"山羊豆"的植物中提取出来的胍类物质，1957年二甲双胍正式应用于临床。从此，与阿司匹林一同扛下“神药”的大旗。二甲双胍是治疗2型糖尿病的“权威”用药，在国内外多种治疗指南中被列为一线降糖药物。该药降糖作用确切，低血糖风险小，价格低廉，是目前应用最为广范的甲类降糖药物之一。近年来，随着研究的深入，二甲双胍还有许多让人惊喜的发现。1、抗衰老作用：美国食品和药物管理局批准了“二甲双胍对抗衰老”的临床试验，可能是因为二甲双胍能增加向细胞中释放的氧分子数量。2、减肥作用：二甲双胍能增加胰岛素的敏感性，减少脂肪的合成。3、心血管保护作用：二甲双胍是目前唯一被糖尿病指南推荐为有明确心血管获益证据的降糖药物。4、改善多囊卵巢综合征：二甲双胍可通过减轻胰岛素抵抗，恢复其排卵功能，改善高雄激素血症。5、抗癌、抑制肿瘤作用：多项流行病学资料显示，二甲双胍可预防肺癌，改善肺癌患者预后。6、改善肠道菌群：二甲双胍能恢复肠道菌群的比例，为肠道有益菌提供优势生存环境，从而起到降低血糖、正向调节免疫系统的作用。7、治疗部分自闭症：《自然》子刊《Nature Medicine》杂志报道，麦吉尔大学的研究人员发现二甲双胍可治疗某些形式自闭症的脆性X综合征。8、治疗骨坏死：二甲双胍可影响骨形成、骨分化和骨矿化，增加股骨头中的血管和新骨形成。
